인플루엔자 A 바이러스의 핵 단백질과 마우스 MX1 단백질의 공동 면역 침전
Summary
This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.
Abstract
Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP–Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.
Introduction
믹소 바이러스 저항 (MX) 단백질은 바이러스 성 병원체에 대한 선천성 면역 방어의 중요한 부분입니다. 이 단백질은 유형 I 및 유형 III 인터페론에 의해 유도되는 큰 dynamin 같은 GTP 아제 있습니다. 대응 MX 유전자는 하나 또는 여러 복사본 거의 모든 척추 동물에 존재하고 이들 유전자 산물은 오르 쏘 믹소 바이러스과 (orthomixoviridae) (예., 인플루엔자 바이러스), Rhabdoviridae (예., 수 포성 구내염 바이러스), Bunyaviridae (예를 포함한 광범위한 바이러스를 억제한다. , 라크로스 바이러스)와 (예를 들어, 인간 면역 결핍 바이러스 1) 1-4 Retroviridae. 이 단백질은 바이러스와 같은 광범위한 인식 방법 명백한 공유 기본 순서가이 바이러스에 모티브없이 그것은 불분명하다. 잠재적으로 그들의 타겟을 갖는 MX 바이러스 단백질의 상호 작용을 분석하는 다른 숙주 세포 인자 고차 복합체를 포함하는, t 분자 메커니즘을 이해하는 데 도움이 될 것모자는 바이러스 및 호스트 사이의 군비 경쟁에 진화했다.
MX 포유류 단백질과 바이러스 표적 사이의 상호 작용은 인간 MXA 위해 가장 광범위하게 연구되어왔다. 인간의 MXA는 orthomyxoviruses 인플루엔자 A와 Thogoto 바이러스를 포함한 많은 바이러스의 복제를 억제 할 수 있습니다. MXA하여 감염 5 블록 결과 핵 항목을 방지 Thogoto 바이러스 리보 핵산 단백질 복합체 (vRNPs)를 결합한다. MXA 및 Thogoto 바이러스 vRNPs 간의 상호 작용은 공동 침전 및 공동 면역 침전 실험 6-9으로 증명되었다. MX 단백질은 인플루엔자 바이러스를 방해하는 방법이 명확하지 않을 수도 있습니다. 하나의 주요 문제는 MX 단백질 및 인플루엔자 유전자 생성물 간의 상호 작용을 보여주기 위해 간단하지 않다는 것이다. 한 보고서는 인플루엔자 바이러스에 감염된 세포 (10) 인간의 MXA 및 NP 단백질 사이의 상호 작용을 보여 주었다. 이러한 상호 작용은 공동 immunopr으로 표시 할 수있다ecipitation 세포 상호 작용이 과도 및 / 또는 약한 것을 시사 용해 전의 가교 시약 디티 오비스 (숙신 이미 딜 프로 피오 네이트)로 처리 된 경우. 보다 최근의 연구는 다른 인플루엔자 균주 차동 MX 감도 11,12 NP 단백질의 기원에 의해 결정된다는 것을 보여 주었다. 이와 라인에서, 인플루엔자 바이러스는 부분적으로 NP 단백질 (13)의 특정 잔류 물을 돌연변이에 의해 MX 컨트롤에서 탈출 할 수 있습니다. 이것은 호스트 MX 대 인플루엔자 바이러스의 주요 목표는 NP는 아마도 vRNP 착체에 조립 NP 단백질임을 시사한다. 그러나 이러한 최근의 연구 중 어느 것도 인플루엔자 NP 또는 vRNPs 및 중 인간의 MXA 또는 마우스 MX1 사이의 상호 작용을 보여 주었다 없습니다.
최근 우리가 처음으로 보여, 여기에 상세하게 설명되어 최적화 된 공동 면역 침전 프로토콜 (14)을 가진 인플루엔자 NP 및 마우스 MX1 단백질 사이의 상호 작용. 일반적으로, 공동 난에서mmunoprecipitation은 단백질 – 단백질 상호 작용을 조사하기 위해 가장 자주 사용되는 생화학 적 방법 중 하나이다. 그들의 자연 환경에서 단백질 – 단백질 상호 작용을 조사 할 수 때문에이 기술은 종종 다른 기술, 예를 들면, 효모 두 하이브리드보다 선호된다. 관심의 단백질에 대한 항체를 사용할 수있는 경우 공동 면역 침전은 내생 발현 된 단백질에서 수행 될 수있다. 대안 적으로, 관심있는 단백질은 형질 감염 또는 감염을 통해 세포 내에서 발현 될 수 있으며, 친 화성 태그가 사용될 수있다. 상술 한 이점 이외에, 설명한 공동 면역 침전 프로토콜 약한 및 / 또는 과도 단백질 상호 작용의 검출을 허용한다. 이 프로토콜의 최적화 된 주성분은 세포 용해 완충액에서 N-에틸 말레이 미드 (NEM)의 추가이다. NEM가 6.5-7.5의 pH에서, 예컨대 시스테인의 존재 자유 티올 기와 반응하여 알킬화 시약, 안정한 티오 에스테르를 형성(그림 1). 더 높은 pH에서, NEM은 아미노기와 반응하여 가수 분해를 15 겪을 수있다. NEM는 통상적으로 다이 설파이드 결합 형성을 방지 또는 효소 활성을 억제하기 위해, 자유 티올기를 차단하는 데 사용된다. 예를 들어, NEM은 종종 시스테인 프로테아제 desumoylating 효소를 차단하는 데 사용됩니다. 이 인플루엔자의 단백질은 바이러스 단백질 sumoylation (16) 사이의 상호 작용에 영향을 미칠 수있는 것으로 알려져 있었기 때문에 기재된 공동 면역 침전 프로토콜에서, NEM는 초기 용해 완충액에 포함시켰다. 예기치 않게, NEM의 첨가는 동시 면역에 의한 인플루엔자 NP MX1 및 마우스의 상호 작용을 문서화 키 것으로 판명. NEM의 첨가는 NP-MX1 상호 작용을 검출하는 것이 중요한 이유는 불분명하다. 아마도 상호 작용이 너무 과도 및 / 또는 약합니다. NEM MX1은 특정 형태의, 바이러스 단백질 또는 알 셋째 콤포넌트를 보존함으로써, 예를 들면 상호 작용을 안정화 할 수NENT. NEM 그러한 안정화 효과는 M1, 리보 뉴클레오티드 리덕 타제 억제제 및 젬시 타빈 (F2dC) (17) 사이의 상호 작용, 예를 들면, 이전에 관찰되었다. MX1과 순이익은 모두 NEM에 의해 수정 될 수있는 여러 시스테인 잔기를 포함한다. 예를 들어, 레니 외.의 최근 연구는 stalkless MXA-변형 요오도 아세트 아미드에 의해 수정 될 수있는 세 가지 용매에 노출 시스테인 잔기를 포함 보여 주었다. 세린 이러한 잔류 돌연변이은 MXA의 효소 활성에 영향을 미칠하지만, 이황화 매개 응집 (18)을 방해하지 않았다. 이들 시스테인이 MX1에 보존되기 때문에, 이것은 MX1에서 유사한 시스테인 NEM으로 이러한 영향의 형태 또는 용해도 같이 변형 될 수 있음을 시사한다. 또한,도 NEM MX1의 항 인플루엔자 활성에 필수적이다 MX1,는 GTPase의 활성에 영향을 주며 이에 MX1과 NP 사이의 상호 작용을 안정화 할 수 있습니다. 그러나,는 GTPase ACTI에 NEM의 직접적인 영향NEM 또한 인플루엔자 NP와는 GTPase MX1 단백질 돌연변이 체 (14)의 비활성 상태 사이의 상호 작용을 검출하기 위해 요구되는대로의 MX1 vity는 어렵다. 분명히, 더 많은 연구가 NP-MX1 NEM에 상호 작용의 효과를 해명하는데 필요하다.
요약하면, 상술 한 공동 면역 침전 프로토콜 MX1 바이러스 단백질 및 그 대상 바이러스, 인플루엔자 NP 단백질 사이의 상호 작용을 연구 할 수있다. 이 프로토콜은 또한 특정 단백질의 입체 형태에 의존하는 다른 안정화 약하거나 과도 상호 작용을 연구하는데 사용될 수있다. 입체 형태에 의존하는 특정 단백질 – 단백질 상호 작용은 칼 모둘 린 (19) 칼슘 결합 단백질, 예를 들면, 이전에 설명되었다. 마지막으로, NEM의 유익한 역할은 또한 공동 침전 분석법 등의 단백질 – 단백질 상호 작용을 검출하는 다른 방법에서 사용될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
바이러스 단백질 및 바이러스 표적 사이의 상호 작용을 연구하는 이들 단백질의 항 바이러스기구의 상세를 이해하는 것이 매우 중요하다. 이 새로운 항 바이러스 전략의 개발을위한 기초를 바이러스 및 그들의 호스트가 진화 공동 방법에 대한 새로운 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 여기에 설명 된 최적화 공동 면역 침전 프로토콜 마우스 MX1 단백질 및 그 대상 바이러스, 인플루엔자 NP 단백질 사?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 FWO – 데런, IOF 프로젝트 IOF10 / StarTT / 027 및 겐트 대학교 특별 연구비 BOF12 / GOA / 014에 의해 지원되었다.
Materials
| DMEM high glucose | Gibco | 52100-047 | |
| N-Ethylmaleimide | Sigma | E-3876 | Toxic |
| Igepal CA-630 | Sigma | I-30212 | also known as NP40 |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11 873 580 001 | |
| anti-NP monoclonal antibody | NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository | NR-4282 | ascites blend of clones A1 and A3 |
| anti-RNP polyclonal serum | NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository | NR-3133 | directed against A/Scotland/840/74 (H3N2) |
| Protein G Sepharose 4FF | GE Healthcare | 17-0618-01 | |
| Hyperfilm ECL 18 x 24 cm | GE Healthcare | 28-9068-36 | |
| ECL Western Blotting Substrate | Pierce | 32106 |
Riferimenti
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