마우스 뇌의 좌우 심실의 뇌실막 섬모의 라이브 영상
Summary
고해상도 미분 간섭 대비 (DIC) 현미경을 사용하여, 마우스 뇌 심실 내에 위치 운동성 뇌실막 섬모의 고동의 생체 관찰은 실시간 이미징에 의해 입증된다. 이 기술은 고유의 섬모 박동 주파수의 기록 및 구타 각도뿐만 아니라 세포 내 칼슘 진동 페이싱 등록 할 수 있습니다.
Abstract
Multiciliated 뇌실막 세포는 성인의 뇌에 심실 라인. 이상 기능이나 뇌실막 섬모의 구조는 다양한 신경 학적 결손과 관련이있다. 운동성 섬모 뇌실막 기술의 생체 라이브 영상 전류는 여러 단계를 다음과 섬모의 역학에 대한 자세한 연구를 위해 수 있습니다. 이 단계는 다음과 같습니다 마우스 이산화탄소와 안락사를 톨레도의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 대학의 프로토콜에 따라; vibratome 또는 날카로운 블레이드와 뇌 제거 및 시상 뇌 해부 다음에 두개 절제술은 뇌실막 섬모가 가시화 될 수있는 뇌 측면 심실을 통해 매우 얇은 섹션을 얻었다. 95 % / 5 % O의 존재하에 2 / CO 2 혼합물을 37 ℃에서 둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM) / 하이 글루코스를 함유하는 맞춤형 유리 – 바닥 접시 뇌 슬라이스 포란 살아있는 조직을 유지하는 것이 필수적이다 시실험. 섬모 고해 비디오이어서 고해상도 미분 간섭 현미경을 이용하여 기록된다. 비디오는 섬모 비팅 주파수를 계산하는 프레임 단위로 분석한다. 이것은 그들의 섬모 박동 주파수와 각도에 따라 세 종류 또는 유형에 뇌실막 세포의 뚜렷한 구분을 할 수 있습니다. 또한,이 기술은 뇌실막 세포 특유의 세포 내 칼슘 발진 특성뿐만 아니라, 칼슘 진동에 약리학 적 제제의 효과 및 모양체 비팅 주파수의 특성을 고속 형광 영상 분석의 사용을 허용한다. 또한,이 기술은 섬모 구조 및 섬모 단백질 지역화 연구 면역 촬상에 적합하다. 이는 질병 진단 및 표현형 연구에서 특히 중요하다. 뇌 조직이 죽는 시작으로 기술의 주요 제한은 라이브 운동성 섬모 운동의 감소에 기인한다.
Introduction
섬모 세포 외 환경으로 세포 표면으로부터 연장 감각 미세 소관 기반 소기관이다. "9 + 0"또는 "9 + 2"- 미세 소관들은 조직에 따라 섬모는 두 가지 유형으로 분류 될 수있다. 기능적으로, 그들의 운동에 기초하여, 이러한 운동성 또는 비 – 운동성 섬모 1로 분류 될 수있다. 차 섬모는 일반적으로 "9 + 0"비 운동성 섬모를 나타 내기 위해 사용되는 용어입니다. 이들은 ( '9'로 표시) 아홉 평행 겹 미세 소관 있고 미세 소관의 중앙 쌍 ( '0'로 표시) 내에서 중앙 피복 부재. 그러나, 배아 편측성 규제 등 절점 섬모 일부 "9 + 0"섬모는 2 운동성이다. 한편, 운동성 섬모는 미세 소관 이중선의 추가적인 중앙 쌍, 아홉 병렬 미세 소관 이중선에 더하여, 특징 및 운동성을 촉진하기 네인 모터 단백질과 연관된. 또한, 일부 "9이러한 후각 섬모 등이 "섬모 3 비 운동성이 있습니다. 뇌 심실 및 척수의 중심 관을 긋고 뇌실막 세포는 뇌 심실 4 따라 뇌척수액 (CSF)를 추진 운동성 섬모 특징으로한다.
이 방법의 전반적인 목표는 섬모 역학과 구조적 이상 운동성 연구를 촉진하는 것입니다. 뇌의 건강과 발전은 크게 뇌의 뇌실 내 뇌척수액의 효율적인 순환에 따라 달라집니다. 예를 들어, 정상 뇌척수액의 흐름과 유체 균형은 정상 박동 차례로 신경 세포의 방향 움직임을 조절하는 중요한 역할을하고 세포 이동 (7) 줄기 기능 뇌실막 섬모 5,6 필요합니다. 이러한 비정상적인 뇌실막 섬모 기능 또는 뇌수종과 연관된 비정상적인 CSF 흐름을 초래할 수 구조체로서, 용태가있는 (B)의 심실에서 CSF의 비정상 축적이 존재비. 이것은 결과적으로 두개 내 압력과 머리, 경련, 터널 비전의 점진적 확대, 정신 장애 (8) 증가의 원인이 될 수 있습니다.
기존의 방법에 비해이 기술의 장점은 세 가지 뇌실막 세포 유형을보고 처음 허용한다는 것이다 : I, 고유 모양체 비팅 주파수 및 각도 박동에 근거 II 및 III. 이 뇌실막 세포는 뇌의 뇌실에 특정 지역 내에서 지역화됩니다. 또한, 나이 등과 같은 알코올 및 뇌실막 세포 유형 또는 지역화 변경에 실로 스타 졸과 같은 약리학 적 제제의 효과는 뇌실막 세포의 분류 이전에는 불가능이었다 증명 될 수있다. 실로 스타 졸은 포스-3 저해제, AMP에 캠프 대사 효소이며 세포 내 칼슘도 9를 조절한다. 고속 형광 영상 분석을 이용하여 세포 내 고유의 이미징 및 정량을 허용뇌실막 세포의 칼슘 진동 특성. 예를 들면, 실로 스타 졸 및 알콜 모두 크게 차례로, 뇌실막 섬모 10 의해 뇌척수액 볼륨 여분의 변화로 이어질 수 뇌실막 모양체 비팅 주파수뿐만 아니라, 세포 내 칼슘의 진동 특성을 변경. 요약하면,이 기술은 다른 칼슘 발진 특성 뇌실막 세포의 세 가지 유형 중 첫번째 증거를 제공하는 핵심이다.
다음 섹션에서, 절차의 상세한 단계별 개요는 티슈 제조 및 취급에 세심한주의를 기울이고, 제공된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
실시간 이미징과 뇌 심실 내에 뇌실막 섬모의 신속하고 민감하게 관찰을 제공 형광 현미경 모두 마우스 뇌 조직의 준비를위한 프로토콜은 여기에 설명한다. 이 기술은 뇌실에 한정되지 않는다; 그것은 다른 뇌 심실에서 섬모를 관찰하는 데에 이용 될 수있다. 이 영상 기술은 생체 외 환경에서 섬모의 박동에 의해 뇌척수액의 움직임과 유사한 라이브 스트림을 제공한다. 또한, 섬모의 운동 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors would like to thank Charisse Montgomery for her editing service. A. Alomran’s work partially fulfills the requirements for a master’s degree in Pharmacology.This work is funded by The University of Toledo’s intramural startup fund for W.A.A and NIH grant (DK080640) for S.M.N.
Materials
| DMEM/HIGH GLUCOSE | Cellgro Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30088-03 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | SH30256-01 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-SP | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-2395 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Fluo-2 | TEF Labs | #0200 | |
| DMSO | |||
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1500 | |
| Anti-acetylated a-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T7451 | clone 6-11B1 |
| FITC Anti-mouse antibody | Vector Labs | FI-2000 | |
| Cell Culture plate | VWR Vista Vision | 30-2041 | |
| Cover Slip (18×18) | VWR Vista Vision | 16004.326 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | Leica VT1200S | |
| Cryostat | Leica Biosystems | Leica CM1860 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Nikon | Nikon TE2000 | 60X oil |
| Microscope cover glass 24x60mm | VWR Vista Vision | 16004-312 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| DAPI filter cube | Chroma Technology |
Riferimenti
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