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Immunologia e infezioni

Applicazione di lungo termine colta interferone-γ Enzyme Linked immunospot Assay per la valutazione effettori e memoria delle cellule T risposte a Bovino

Published: July 11, 2015
doi:
10.3791/52833
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1Infectious Bacterial Diseases Research Unit, National Animal Disease Center, Agricultural Research Service,United States Department of Agriculture, 2Department of Veterinary Pathology, College of Veterinary Medicine,Iowa State University, 3UK Veterinary Laboratories Agency, 4Visual Services, National Centers for Animal Health, Animal and Plant Health Inspection Service,United States Department of Agriculture

Summary

A lungo termine colta interferone-γ enzimatico test immunospot viene usato come misura di risposte di memoria centrale e correla con le risposte vaccino anti-micobatteri protettivi. Con questo test, le cellule mononucleari del sangue periferico sono stimolati con antigeni micobatterici e interleuchina-2 per 14 giorni, differenziazione e consentendo l'espansione delle cellule T di memoria centrale.

Abstract

Cellule effettrici e T di memoria sono generati attraverso la programmazione di sviluppo delle cellule naïve a seguito del riconoscimento dell'antigene. Se l'infezione è controllata fino al 95% delle cellule T generati durante la fase di espansione sono eliminati (es., La fase di contrazione) e le cellule T di memoria rimangono, a volte per tutta la vita. Nell'uomo, due sottoinsiemi funzionalmente distinte di cellule T di memoria sono state descritte sulla base dell'espressione di recettori homing linfonodali. Le cellule T di memoria centrale esprimono CC recettore di chemochine 7 e CD45RO e si trovano principalmente nelle zone a cellule T degli organi linfoidi secondari. Le cellule T di memoria Effector esprimono CD45RO, mancano CCR7 e di visualizzazione dei recettori associati alla linfociti homing ai tessuti periferici o infiammati. Cellule T effettrici non esprimono né CCR7 o CD45RO ma su incontro con citochine effettrici antigene producono, come l'interferone-γ. Saggi di rilascio di interferone-γ sono utilizzati per la diagnosi di bovini e tubercolosi umana erilevare soprattutto effettrici e memoria le risposte delle cellule T effettrici. T memoria centrale risposte cellulari di cellule CD4 + T alla vaccinazione, d'altro canto, possono essere usati per predire l'efficacia del vaccino, come dimostrato con simian virus dell'immunodeficienza di primati non umani, la tubercolosi nei topi, e la malaria nell'uomo. Diversi studi con i topi e gli esseri umani, nonché i dati pubblicati per i bovini, hanno dimostrato che l'interferone-γ saggi ELISPOT misurare memoria centrale le risposte delle cellule T. Con questo test, le cellule mononucleate del sangue periferico sono coltivate in una minore concentrazione di antigene per 10 a 14 giorni (a lungo termine cultura), consentendo risposte effettrici a picco e calare; facilitando le cellule T di memoria centrale per differenziare ed espandere all'interno della cultura.

Introduction

Cellule effettrici e T di memoria sono generati attraverso la programmazione di sviluppo delle cellule T CD4 + naive dopo il riconoscimento dell'antigene. Differenziazione delle naïve cellule T CD4 + in cellule producenti citochine richiede il riconoscimento dei patogeni dalle cellule immunitarie innate, presentazione dell'antigene alle cellule T, co-stimolazione e cambiamenti trascrizionali con conseguente produzione di citochine polarizzato. Ad esempio: le cellule presentanti l'antigene producono interleuchina (IL) -12 in risposta a patogeni intracellulari, che, insieme con il riconoscimento dell'antigene, promuove la differenziazione delle cellule T in T helper 1 (Th1) 1,2 segnalando mediante trasduttore di segnale e attivatore di trascrizione 4 (STAT4) e T-box espresse nelle cellule T (T-bet), che porta alla attivazione delle cellule, IL-2, l'espansione clonale e interferone (IFN) la produzione -γ 3,4. Se l'infezione è controllato, fino al 95% delle cellule T generati durante la fase di espansione sono eliminate (cioè, la contrazionecellule in fase) e T memoria rimangono, a volte per tutta la vita 5. Sallusto et al. 6, ha rivelato due sottoinsiemi funzionalmente distinti di cellule T di memoria negli esseri umani sulla base dei recettori homing linfonodali. Le cellule T di memoria centrale (TCM) esprimono il recettore per chemochine CC (CCR) -7 e CD45RO e si trovano principalmente nelle zone a cellule T degli organi linfoidi secondari. Funzione effettrici, una soglia di attivazione bassa e mantenere alta di IL-2 e capacità proliferativa Tcm hanno limitato. La memoria delle cellule T effettrici (TEM) esprimono CD45RO, mancano i recettori CCR7 e visualizzazione per homing ai tessuti periferici o infiammati. Cellule effettrici non esprimono né CCR7 o CD45RO ma prontamente producono citochine effettrici, come IFN-γ, al momento della rilevazione dell'antigene.

Saggi di rilascio di IFN-γ (IGRA) sono utilizzati per la diagnosi di bovini e tubercolosi umana 7. Mycobacterium bovis è l'agente principale della tubercolosi bovina (BTB) mentre ca umanoses della tubercolosi è causata principalmente da Mycobacterium tuberculosis. Con questi test, sangue intero o cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) vengono stimolati con antigeni dei micobatteri per 16 a 24 ore e la produzione di IFN-γ entro il surnatante viene misurata mediante ELISA o attraverso il rilevamento di cellule che producono IFN-γ utilizzando tecniche ELISPOT. Come risultato del breve periodo di stimolazione (ie., 16 a 24 h) e la produzione di citochine rapida, ex vivo saggi rilevano principalmente effettrici e TEM risposte. Questo è stato confermato mediante analisi citofluorimetrica di popolazioni cellulari in queste culture 8-10.

Ex vivo risposte IFN-γ sono abitualmente inclusi nella valutazione immunitaria pannello di risposta di vaccini contro la tubercolosi, compresi quelli utilizzati per valutare le risposte da parte del bestiame. La maggior parte delle efficaci vaccini contro la tubercolosi bovina inducono risposte IFN-γ specifici, ma non tutti i vaccini che inducono risposte IFN-γ sono Protective. Inoltre, i livelli di IFN-γ suscitato dalla vaccinazione, misurata prima dell'infezione, non sono necessariamente correlati con la protezione. Ad esempio, diversi ceppi di BCG possono avere diverse capacità di indurre ex vivo risposta IFN-γ, nonostante livelli di protezione analoghi 11. Così, ex vivo IGRA sono utili per la diagnosi della tubercolosi e di accedere immunogenicità del vaccino; Tuttavia, il loro impiego come predittori di efficacia del vaccino è limitata. Risposte Tcm alla vaccinazione, d'altro canto, possono essere usati per predire l'efficacia del vaccino, come dimostrato con il virus dell'immunodeficienza delle scimmie (SIV) infezione in primati non umani, 12,13 tubercolosi in topi 14 e malaria nell'uomo 15,16.

Dopo una risposta immunitaria efficace conseguente passaggio patogeno, Tcm sono mantenuti e fornisce protezione per un eventuale secondo infezione da parte dello stesso agente. Una notevole eccezione a questo scenario è M. tubercolosi infection degli esseri umani in cui i pazienti sottoposti a terapia anti-micobatteri curative sono suscettibili di re-infezione 17,18. Inoltre, gli eventi che regolano memoria immunologica durante le infezioni croniche, in cui la stimolazione antigenica persiste, non sono ben compresi 19. Durante infezioni croniche, come ad esempio con il virus dell'immunodeficienza umana (HIV) e la tubercolosi, una significativa risposta Tcm è associato a un esito favorevole (ad esempio, la latenza con la tubercolosi e le malattie subclinico con HIV) 20,21. Diversi studi con i topi e gli esseri umani hanno dimostrato che a lungo termine in coltura saggi ELISPOT IFN-γ misurano risposte Tcm 16,20-22. Con questo test, PBMC sono coltivati ​​in diminuzione concentrazione dell'antigene per 10 a 14 giorni, consentendo risposte effettrici a picco e calare; facilitando Tcm di differenziare ed espandere all'interno della cultura.

A lungo termine in coltura IFN-γ saggi ELISPOT sono stati utilizzati anche in veterinariaricerca, ma il fenotipo di cellule rispondenti è stato difficile da valutare a causa della mancanza di reagenti critici, in particolare un anticorpo per CCR7. Efficaci vaccini contro la tubercolosi bovina [ad es. utilizzando una singola dose di M. bovis Bacille Calmette Guerin (BCG), BCG seguita da vaccino subunità Antigen 85A virale vettorizzate, o M attenuati. bovis ΔRD1] suscitare a lungo termine-IFN γ coltivate risposte ELISPOT dopo la vaccinazione che correlano con la protezione (cioè, più basso onere micobatteri e diminuzione TB-associato di patologia) contro la successiva sfida con virulenta M. bovis 23,24. Inoltre, il numero di cellule-IFN-γ secernenti antigene-specifiche all'interno PBMC colture a lungo termine sono superiori a 12 mesi, ma diminuiscono a 24 mesi dopo la vaccinazione BCG di vitelli neonati, correlando con il grado di protezione rilevabile posta M. bovis sfida 25. In questo scenario, il colto IFN-γ ELISPOT è unstrumento n importante per prevedere l'efficacia del vaccino, fornendo un mezzo per dare priorità candidati vaccini per le prove di efficacia di costo elevato. Inoltre, le tecniche ELISPOT coltivate possono essere adattate per diversi host, agenti patogeni e citochine alterando antigeni o anticorpi per una varietà di scopi in diversi campi di ricerca.

Protocol

1. Preparare le soluzioni di seguito Preparare RPMI completo (cRMPI) aggiungendo siero fetale bovino (FBS) ad una concentrazione di 10% (volume / volume), glutammina (2 mM), piruvato di sodio (1 mM), aminoacidi non essenziali (0,1 mM), penicillina -streptomycin (100 unità / ml di penicillina e 0,1 mg / ml di streptomicina) e 2-mercaptoetanolo (50 mM) in RPMI 1640. Preparare 2 X citrato acido destrosio, mescolando citrato di sodio (77 mM), acido citrico (38 mM), e il destrosio (122 mM), in acqua distillata. Preparare Ca 2+ Mg 2 + fosfati salina tamponata (PBS) pH 7,2: NaCl (137 mm), KCl (2,7 mm), Na 2 HPO 4 (dibasico, 10 mM), KH 2 PO 4 (monobasico, 2 mm) in acqua distillata; regolare il pH a 7,2. Preparare PBS 1% (PBS 1% BSA) aggiungendo sieroalbumina bovina in PBS (peso / volume, 1 g / 100 ml di PBS). Preparare PBS + 0,05% Tween 20(PBST) aggiungendo 0,05% di Tween 20 in PBS (volume / volume, 500 microlitri di Tween 20/1 L di PBS). Preparare 100 mM Tris HCl pH 8,2 tampone mescolando Tris (100 mM), HCl (0,50 mM) in acqua distillata. Preparare la soluzione di etanolo al 35% diluendo alcool etilico (purezza ≥99.5%) in acqua distillata (volume / volume, 35 ml di alcool etilico / 100 ml di acqua distillata). Filtro sterilizzare cRPMI, 2 x acido citrato destrosio, PBS, PBS 1% di BSA con 0.22 micron filtri. 2. cellule in coltura a lungo termine (14 giorni Protocol) (Giorno uno) Preparare le soluzioni di antigene al doppio della concentrazione finale in cRPMI. Scelta Antigen è critica e dovrebbe essere adattata allo scopo dello studio. Diluire ricombinante M. tubercolosi antigeni TB10.4 e antigene Ag85A a 2 mg / ml (di ciascun antigene, la concentrazione finale è di 1 mg / ml). Diluire M. bovis derivato proteico purificato(PPD-B, Prionics Ag) a 10 mg / ml (concentrazione finale 5 mg / ml). Diluire il ricombinante secretoria precoce bersaglio antigenico 6 (ESAT-6) e cultura filtrato proteina 10 (CFP-10) proteina di fusione (resat-6: CFP10) a 2 mg / ml (concentrazione finale di 1 mg / ml). NOTA: Questi antigeni sono immunodominante IFN-γ induce gli antigeni di micobatteri tubercolari e possono essere inclusi per stimolare PBMC da M. bovis infettato gli animali. BCG o M. bovis ΔRD1 vaccinati gli animali non rispondono a resat-6: CFP10 come la regione codificante questi antigeni (vale a dire, RD1) è cancellata in questi ceppi. resat-6: CFP10 utilizzato in questi studi è stato un gentile dono del Dr. C. Minion, Iowa State University. TB10.4 e l'antigene Ag85A sono antigeni immunodominanti presenti nel virulenta e vaccino M. bovis ceppi 37. PPDB, come un derivato proteico purificato, è un complesso di vari antigeni inclusi gli antigeni condivisi con micobatteri non tubercolari. Infecanimali ted saranno potenzialmente rispondere a tutti gli antigeni (vale a dire: TB10.4, Ag 85A, resat-6: CFP10 e PPDB), mentre gli animali vaccinati non dovrebbero rispondere a resat-6: CFP10 11. Piatto 500 microlitri / pozzetto di soluzione di antigene nel quadruplicates per ogni animale in una piastra ben 24. Per questo protocollo, utilizzare antigeni come una piscina; quindi utilizzare tutti i pozzetti contengono tutti gli antigeni e senza controlli (come, nullo o mitogeno) questo passaggio. Incubare la piastra a 39 ° C / 5% di CO 2. La temperatura normale di bestiame è di 39 ° C; in tal modo, alcuni ricercatori utilizzano 39 ° C per la coltura di cellule bovine. Inoltre, in alcuni casi con le cellule umane, coltura cellulare a 39 ° C fornisce beneficio 26,30 aggiunto. Siringhe pre-carico accoppiato con 16 o 18 G aghi ipodermici con 6 ml di 2 X acido-citrato-destrosio; e raccogliere 60 ml di sangue bovino mediante prelievo venoso giugulare. Isolare PBMC dalla norma gradiente di densità centrifugazione del sangue periferico frazioni cappotto buffyregolando la concentrazione cellulare a 4 x 10 6 cellule / ml come descritto da Maue et al. 27 Aggiungere cellule (500 microlitri / pozzetto) in antigene precaricate 24 pozzetti, in quadruplice copia per ogni animale (passo 2,5). Incubare la piastra a 39 ° C / 5% di CO 2. (Tre giorni e sette) Usando una tecnica sterile, rimuovere con cautela 500 ml di surnatante da ogni pozzetto senza disturbare lo strato di cellule. Ricostituire il volume ben aggiungendo 500 microlitri / pozzetto di cRPMI contenente IL-2 (30 U / ml, cioè, 15 U / bene, IL-2 ricombinante umana Sigma I7908). Incubare la piastra a 39 ° C / 5% di CO 2. (Giorni 10 e 12) Usando una tecnica sterile, togliere 750 ml di surnatante da ogni pozzetto. Ricostituire il volume con 750 microlitri / pozzetto di cRPMI (senza IL-2). Incubare la piastra a 39 ° C / 5% di CO 2. <pclass = "jove_title"> 3. ELISPOT Assay (Three Day Protocol) (Primo giorno (12 ° giorno di protocollo cultura a lungo termine)) Etichettare la piastra ELISPOT correttamente per ogni serie di campioni, per evitare errori quando placcatura cellule: cellule a lungo termine più cellule presentanti l'antigene (APC), cellule-lungo termine senza APC e ex vivo cellule / a breve termine (Figura 1). Replica per ogni trattamento (cioè stimolazione antigenica) dovrebbe essere fatto almeno in doppio. Preparare la soluzione anticorpo di cattura diluendo topo anti bovina anticorpo IFN-γ (MCA2112, clone CC330) in PBS (8 mg / ml). Utilizzando una pipetta multicanale pre-bagnare le pozzetti della piastra ELISPOT con 15 ml / pozzetto di 35% di etanolo per 1 min. Per evitare di danneggiare la membrana, non toccare il fondo dei pozzi con punte di pipette in qualsiasi momento durante il test. Lavare la piastra sei volte con 300 ml / pozzetto di PBS. Liquido di lavaggio deve essere eliminata dalla piastra di inversione. Lava dovrebbe essere fatto rapidamente, non permettendo pozzetti della piastra a secco. Dispensare 100 ml / pozzetto di cattura degli anticorpi anti-IFN-γ (dal punto 1 sopra). Incubare a 4 ° CO / N (mantenere il piatto all'interno di una custodia con cerniera). (Secondo giorno (13 ° giorno del protocollo coltura a lungo termine)) Preparare le soluzioni di antigene al doppio della concentrazione finale. I trattamenti sono: nessuna stimolazione (cRPMI), PPD-B (20 ug / ml, concentrazione finale: 10 mg / ml), proteina cocktail di TB10.4 e Ag85A (2 ug / ml di ogni proteina, concentrazione finale: 1 mg / ml di ciascuna proteina), resat-6: CFP10 (per infezione da M. bovis, 2 ug / ml, concentrazione finale: 1 mg / ml) e un controllo positivo, ad esempio pokeweed (20 pg / ml, concentrazione finale: 10 mcg / ml). Altri mitogeno possono essere utilizzati al posto di PWM (ad esempio, Concanavalina A). NOTA: per questo passo antigeni comporre quattro diversi trattamenti e sono not usato come una piscina (come nel passaggio 2.5). I quattro trattamenti sono: NS, PPDB, cocktail di proteine ​​(TB10.4 e Ag85A costituiscono un trattamento) e PWM. Colture Cellulari 4. A breve termine e Cell Aderenti (APC) Isolamento Raccogliere 60 ml di sangue dagli stessi animali dissanguati al giorno 1 (sotto: a lungo termine cultura, 14 protocollo giorno) e isolare PBMC come prima. Regolare la concentrazione cellulare di 2 x 10 6 cellule / ml. Etichettare le provette chiaramente per evitare cattiva allocazione quando placcatura cellule. Queste cellule saranno utilizzate per l'isolamento APC e anche come coltura cellulare a breve termine (passo 6.5). Etichettare le provette con sia il numero di animali e il tipo di coltura (in questo caso: ex vivo, a breve termine o cellule fresche). Rimuovere anticorpo di cattura in eccesso dal ELISPOT dal piatto inversione. Lavare le piastre 6 volte con 300 microlitri PBST. Rimuovere il più possibile PBST. Pipettare 50 ml di sospensioni cellulari ai pozzetti etichettati come celle a lungo termine più APC. Blocco altro wells con 200 pl / pozzetto di cRPMI. Incubare 90 minuti a 39 ° C o Pre-caldo cRPMI o 39 ° C (necessario per le fasi successive). PBMC fresche non utilizzati per cellule aderenti (APC) isolamento saranno necessari in fasi successive e devono essere conservati. 5. cellule in coltura Durante la 90 min di incubazione (passo 4.4, la cultura a breve termine e aderente passo isolamento delle cellule), cellule in coltura a lungo termine di raccolta. Utilizzando 5 o 10 pipette microlitri, media pipette con celle su e giù per staccare le cellule, unire il quadruplice replica da ogni animale in un unico tubo da 15 ml. Centrifugare le provette per 5 minuti a 400 g. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante dal tubo inversione. Rimuovere pellet. Aggiungere 5 ml di PBS, delicatamente risospendere pellet, se necessario. Ripetere la centrifugazione. Ripetere la fase di lavaggio due volte. Gettare il surnatante dal tubo inversione e delicatamente risospendere le cellule in 1 ml cRPMI. Regolare la concentrazione cellulare2 x 10 5 cellule / ml. 6. placcatura Fresco e PBMCs coltivate Dopo il 90 min di incubazione, agitare piatti su tavola oscillante per 30 sec. Rimuovere le cellule non aderenti dal piatto d'inversione. Dispensare 150 ml / pozzetto di caldo cRPMI (dal punto 4, sotto: celle a breve termine e di cellule aderenti (APC) passo isolamento). Agitare le piastre e scartare liquido di lavaggio. Ripetere il lavaggio per 3 volte. Aggiungere 100 ml / pozzetto di ciascun antigene in appositi pozzetti (pre-etichettati). Per piastra cellule, pipetta 100 l / pozzetto di sospensione di cellule in coltura a lungo termine (2 x 10 5 cellule / ml) nei pozzetti etichettati come celle a lungo termine più APC. Assicurarsi che le celle a lungo termine aggiunti in questa fase sono dello stesso animale come APC già nel pozzo. Non mescolare cellule in coltura a lungo termine di APC e da diversi animali. Dispensare 100 l / pozzetto di sospensione cellulare in coltura a lungo termine (2 x 10 5 cellule / ml) in pozzi senza APCs per la valutazione del fabbisogno APC alla risposta a lungo termine cultura. Aggiungere 100 l / pozzetto di cellule a breve termine (appena isolati e regolati a 2 x 10 6 cellule / ml) per ex vivo valutazione della risposta. Incubare le piastre O / N a 39 ° C / 5% di CO 2 incubatore. Assicurarsi che le piastre sono distesi e non impilare piatti. NOTA: Se si desidera analisi del fenotipo cellulare, citometria a flusso può essere eseguita come un saggio accessoria. Le cellule sono placcati in 96 piatti ben U inferiori (invece di ELISPOT piastre), come descritto per il saggio ELISPOT. Capture adsorbimento degli anticorpi (passi 3,4-3,5) dovrebbe essere saltato. Le cellule vengono poi incubate O / N a 39 ° C / 5% di CO2 e un protocollo di colorazione cella standard eseguita. Reagenti di colorazione delle cellule sono inclusi nella tabella di reagenti. Il terzo giorno (14 ° giorno del protocollo di coltura a lungo termine) Diluire anticorpo di rilevazione (topo anti-IFN-γ bovina, clone CC302) a 5 ug / ml in PBS 1% BSA. Eliminare i liquidi dai pozzi e lavare i piatti: sei volte con PBST (300 ml / pozzetto), l'immissione sul shaker ogni volta per 10 secondi prima e in-tra un lavaggio e, una volta con dH 2 O (300 ml / pozzetto), un ulteriore 6 volte con PBST (300 ml / pozzetto) e due volte con PBS (300 ml / pozzetto). Dopo le cellule vengono rimosse dalle piastre, e se non si applicano le preoccupazioni biosicurezza, le procedure possono essere eseguite fuori cappe di sicurezza biologica. Liquido di lavaggio degli Scarti. Rimuovere il più liquido di lavaggio possibile toccando piastra su carta assorbente. Aggiungere anticorpo di rilevazione (100 l / pozzetto). Incubare le piastre per 120 minuti a 39 ° C o Durante questa fase di incubazione, preparare la soluzione fosfatasi alcalina seguendo le istruzioni del produttore. Trenta minuti prima dell'uso (cioè, 90 min dopo l'aggiunta di anticorpo di rilevazione pozzetti) diluire il reagente in PBST. Capovolgere delicatamente la provetta per mescolare i reagenti e incubate a RT. Dopo il 120 min incubazione, scartare anticorpo di rilevazione in eccesso dal piatto d'inversione. Piastra Lavare 6 volte con PBST (300 ml / pozzetto). Rimuovere il più liquido di lavaggio possibile toccando piastra su carta assorbente. Aggiungere 100 ml / pozzetto di soluzione di fosfatasi alcalina (dal punto 3 sopra). Incubare le piastre per 45 minuti a temperatura ambiente. Eliminare fluido e lavare ogni piastra 6 volte con PBST (300 ml / pozzetto). Preparare la soluzione di substrato seguendo le istruzioni del produttore (Vector Blue AP substrato III): Diluire reagenti in 100 mM Tris HCL pH 8,2 tampone. Pipettare 50 ml / pozzetto di soluzione di substrato. Incubare a RT fino colore blu inizia a sviluppare (circa 30 min). Eliminare fluido e lavare i piatti con abbondante dH 2 O. Rimuovere la piastra inferiore per esporre membrana, lavare indietro di pozzi e lasciare asciugare la piastra all'aria. Leggi piatti su analizzatore immunospot immagine o lettore ELISPOT (Tabella 1), oppure manualmente, utilizzando uno stereomicroscopio. In alternativa, tenere piattiin buio a RT fino lettura. A causa della elevata stabilità del substrato di reazione, la qualità è conservato per diversi anni. Nota: le celle e le concentrazioni di antigene sono stati ottimizzati per evitare i pozzi con macchie innumerevoli 23,24,27,37. E 'possibile che la formazione macchie innumerevoli verifica in contesti diversi oa causa di variazione biologica. Se questo è il caso, concentrazione cellulare dovrebbe essere ottimizzato in modo da ottenere una risposta di conteggio posto leggibile. 7. Piastre di lettura e di analisi dei dati Eseguire l'analisi secondo la Cellular Technology Limited (CTL) piastra ELISPOT guida lettore (Tabella 1). Dopo le macchie conteggi sono ottenuti per ciascuno dei pozzetti, calcolare la media tra duplicati. La risposta immunitaria specifica per ogni stimolo antigenico viene calcolato sottraendo il numero medio di punti in pozzetti non stimolati da quella dei pozzi antigene-stimolata.

Representative Results

Circa un mese infezioni post-aerosol con M. bovis (10 4-unità formanti colonia), PBMC da infetto (n = 8) e gli animali di controllo (n = 8) sono state coltivate in presenza di antigeni e di IL-2 per 13 giorni. Sviluppo delle risposte Tcm dopo l'infezione è stata determinata utilizzando IFN-γ ELISPOT. Rappresentante Tcm (in presenza o assenza di APC) e ex vivo IFN-γ risposte ELISPOT da animali infetti (Tre animali) e una con infezione non animali (un animale) sono illustrati nella Figura 1. Un successo a lungo termine IFN-γ ELISPOT risultati del test in cellule che producono IFN-γ (Spot-Forming Cells, SFC) in condizioni stimolati e quasi assenza di una risposta da animali non infetti e in condizioni di non-stimolata. Inoltre, una forte risposta delle cellule T deve verificarsi in risposta a PWM. Risposte specifiche alla M. bovis è stata effettuata dal PPD-B o resat-6: stimolazione antigenica CFP10. Come mostrato in figura1, robusto Tcm ed ex risposte vivo a PPD-B e resat-6: CFP10 sono stati rilevati da tutti e tre M. bovis -infected animali. Minimo di no Tcm ed ex vivo le risposte sono stati rilevati dagli animali di controllo. Inoltre, la presenza di APC è stato richiesto per ottimali risposte Tcm di animali infetti, come dimostrato dalle risposte notevolmente ridotta di cellule a lungo termine coltivate in assenza di APC autologhe. Risposta IFN-γ da PBMC da M. bovis infetti e animali non infetti sono presentati in figura 2. Il numero di SFC da ogni animale è stato calcolato come il numero medio di SFC in campioni duplicati in risposta al PPD-B meno la rispettiva risposta ai soli mezzi. Le risposte sono state stimate per 10 6 cellule. Risposte differivano (P <0,05) sulla base da infezione, presenza o assenza di APC e durata di coltura (cioè., A lungo termine coltura ex vivo contro cultura). <table border="0" cellpadding = "cellspacing" "0" = "0"> Acquisizione immagine di piastre 1. Accendere la macchina 2. Apri "Immuno Capture" software Versione 6.3. 3. Fase 1: selezionare il tipo di piatto. 4. Fase 2: piatto di carico. 5. Fase 3: selezionare le opzioni di scansione. 6. Fase 4: avviare la scansione. 7. Ottieni panoramica immagine del piatto. 8. Espellere piatto. 9. Uscire da software "Immuno Capture". Contando le unità in loco la formazione 1. Apri "Immuno Spot Capture" software versione 5.0. 2. Seleziona objec Tipo di t: normale. 3. Seleziona modulo di conteggio: conteggio intelligente. 4. Fase 1: piatto di carico. 5. Passo 2: definire i parametri di conteggio: l'accuratezza del test di riconoscimento posto in pozzetti con punti diversi. 6. Avviare conteggio automatico. Controllo qualità 1. Apri "immunospot Capture" software versione 5.0. 2. Seleziona modulo di conteggio: il controllo di qualità. 3. Fase 1: piatto di carico. 4. Fase 2: Analizzare i pozzi evidenziati individualmente. 5. Finire il controllo di qualità. Tabella 1 – AutoImmun Diagnostika ELISPOT acquisizione delle immagini del lettore e cellule contare procedura. ove_content "fo: keep-together.within-page =" always "> Figura 1. Immagine di pozzi da un IFN-colta a lungo termine γ ELISPOT. Colta-IFN γ ELISPOT test è stato eseguito approximatelyone mese dopo la sfida con virulenta M. bovis (tre animali). Animali non infetti sono stati inclusi come controlli (un animale) linee cellulari a lungo termine sono stati generati stimolando PBMC con un cocktail di Ag85A ricombinante (1 mg / ml), TB10.4 (1 mg / ml), resat-6.: CFP10 (1 mg / ml) e PPD-B (5 mg / ml) per 13 giorni, seguita da trasferimento piastre ELISPOT in presenza o assenza di APC autologhe. Celle a breve termine costituite da PBMC isolato su giorno 13 e placcato direttamente nei piatti ELISPOT. Celle a lungo termine ea breve termine sono state stimolate con PPD-B (10 mg / ml), resat-6: CFP10 (1 mg / ml), solo a medio o pokeweed mitogeno (5 &# 956; g / ml) per 24 h. Figura 2. Risultati rappresentativi di un IFN-colta a lungo termine γ ELISPOT risposta a M. bovis derivato proteico purificato (PPD-B). dosaggio coltivate IFN-γELISPOT è stata eseguita approximatelyone mese dopo la sfida con virulenta M. bovis (otto animali). Animali non infetti sono stati inclusi come controlli (cellule otto animali a lungo termine sono stati generati stimolando PBMC con un cocktail di Ag85A ricombinante (1 mg / ml), TB10.4 (1 mg / ml), resat-6: CFP10 (1 ug / ml) e PPD-B (5 mg / ml) per 13 giorni, seguita da trasferimento piastre ELISPOT in presenza o assenza di APC autologhe. celle a breve termine consistevano PBMC isolato su giorno 13 e placcato direttamente nella piastra ELISPOT . a lungo termine e shocellule RT-termine sono state stimolate con PPD-B (10 mcg / ml) o solo terreno per 24 h. Risposte specifiche di ogni animale (10/6 cellule SFC) sono presentati come risposta al PPD-B (media dei campioni di duplicati) meno la risposta ai soli mezzi.

Discussion

La produzione di IFN-γ in-lungo termine saggi ELISPOT coltivate è generalmente a causa di Tcm negli esseri umani, ma come questa risposta si sviluppa nella cultura è poco conosciuta. Sia Tcm sono presenti in circolazione ed espandere in vitro, o se le risposte Tcm risultato di differenziazione delle cellule effettrici e Tem in Tcm durante la cultura non è nota. Tuttavia, gli studi con campioni provenienti da esseri umani hanno scoperto che le cellule T CD4 + da ex vivo e lungo termine saggi di IFN-γ colto ELISPOT hanno specificità epitopi indipendenti, il che implica che le risposte Tcm non si sviluppano da cellule effettrici 28. Ovviamente, la durata della risposta può variare, ma se si ottiene un rinvio patogeno, eventualmente sia ex vivo e risposte Tcm diminuire. Inoltre, le risposte di colture a lungo termine, calcolato in anticipo e molto tempo dopo adescamento antigenica (quando la risposta effettrici è inferiore) è mostrato di correlare, indicando che circolano popolazioni Tcm presto e poco dopo contropriming genica resta legato in vivo. D'altra parte, l'ampiezza della risposta ex vivo non sembra essere correlato alla grandezza della risposta di memoria 29. Questi risultati suggeriscono che a lungo termine-IFN γ coltivate risposte ELISPOT risultato di espansione in vitro di Tcm e un declino associato delle risposte effettrici nel campione, piuttosto che la differenziazione delle cellule effettrici in Tcm fenotipo.

Con il bestiame, il contributo relativo di effettori memoria e sottoinsiemi di risposte rilevato dai test a lungo termine IFN-γ ELISPOT non è noto. Studi recenti indicano una correlazione tra il vaccino ha suscitato a lungo termine-IFN γ coltivate risposte ELISPOT e protezione contro successiva infezione sperimentale con M. bovis 23-24. E 'stato riportato che deboli a lungo termine IFN-γ risposte ELISPOT alla vaccinazione sono associati con la mancanza di protezione 30. Entrambi vivono e ucciderevaccini ndr inducono ex vivo IFN-γ ELISPOT risposte simili, ma la vaccinazione con BCG vivo suscita a lungo termine-IFN γ coltivate risposte ELISPOT più forte di fare preparati vaccinali uccisi. È interessante notare che, vaccini vivi sono protettivi mentre formulazioni uccisi non riescono a fornire protezione contro sfida con virulenta micobatteri tubercolare 31-32, 33.

La valutazione delle risposte Tcm è anche fattibile di classificare queste cellule da PBMC. Arricchimento diretto di Tcm da PBMC, tuttavia, richiede dispositivi costosi, altamente addestrati personale ed è difficile come queste cellule non sono numerosi nel sangue. Cultura a lungo termine di PBMC fornisce arricchimento di Tcm su Tem e cellule effettrici senza costosi dispositivi; Tuttavia, poiché queste popolazioni di cellule T sono espanse in vitro possono essere meno rappresentativi delle risposte di memoria in vivo. E 'possibile accedere a risposte IFN-γ di memoria (con la cultura a lungo termine o Tcm sortaing strategie) di saggi di diverse dalla ELISPOT quali: ELISA citochine 34, array di citochine tallone (CBA), colorazione intracellulare (ICS), o array proteici citochine (CPA). Questi metodi; tuttavia, sono generalmente meno sensibile ELISPOT Saggi 35.

Un vantaggio di ELISPOT è la sua capacità di rilevare la cattura immediata della citochina poco dopo la sua uscita impedendo diluizione nel surnatante e degradazione da taglio enzimatico o citochine assorbimento da altre cellule. Saggi ELISPOT rilevare singole cellule che producono citochine che forniscono risultati precisi anche in condizioni di scarsa segnale scenari rumore (cioè, risposte specifiche a basso) 35. Inoltre, con ICS, rilevamento di citochine prima del rilascio può causare falsa identificazione di cellule producenti citochine (ad es., A causa di modulazione post-traduzionale prima o durante il processo di secrezione) 34. Gli inibitori di trasporto utilizzato con ICS test per ridurre al minimo la secrezione di citochinedurante la stimolazione antigene (noto come proteine ​​arresto Golgi) limitare la durata di stimolazione cellulare a causa della tossicità cellulare di queste proteine ​​in definitiva influiscono produzione di citochine 35.

Detto – CBA, CPA e ICS sono tecniche utili per la misurazione di più citochine simultaneamente e / o per la determinazione dell'espressione marcatore di superficie cellulare (cioè con ICS.). Pertanto, questi metodi possono essere utilizzati in combinazione con l'IFN-γ ELISPOT test 36. Mentre precedenti TB bovina studi di efficacia vaccino misurati risposte Tcm via saggio ELISPOT, l'individuazione di risposte Tcm con altre tecniche probabilmente produrrà risultati comparabili. È importante sottolineare che il saggio ELISPOT è meno costoso e più semplice da eseguire rispetto CBA, CPA e analisi tecniche di ICS 34. Conteggio manuale del SFC è un'alternativa al conteggio automatico e piastre ELISPOT può essere conservato a temperatura ambiente per lunghi periodi di tempo, con perdita di qualità minima, prima o dopo il punto contaggio 37.

Il lungo termine colta-IFN γ ELISPOT risposta è stata applicata per valutare le risposte di memoria da umani, e bovini nel valutare le risposte vaccino tubercolosi 14-16,31-32,33. Risposte Tcm sono anche assunto a svolgere ruoli significativi nella risposta dell'ospite a diversi altri agenti infettivi di bovini, come ad esempio:. Mycoplasma mycoides subsp mycoides 42, Anaplasma marginale 38 e bovino virus respiratorio sinciziale 39. Potenzialmente, il saggio ELISPOT a lungo termine potrebbe essere adattato per altre specie animali, citochine e infezioni. Queste applicazioni più ampie saranno particolarmente utile per le applicazioni immunologia veterinaria a causa della corrente limitata disponibilità di reagenti specifici.

Risposte Tcm sono cruciali per la protezione contro diverse infezioni, ma li misura presto dopo l'infezione / l'immunizzazione (per la previsione esito della malattia o l'efficacia del vaccino) may essere ingombrante. Analisi della risposta immunitaria in ex vivo e corte condizioni stimolazione antigenica sarà più rappresentano spesso risposte effettrici, a causa della sovrapposizione di memoria e risposte effettrici, in particolare durante l'inizio della formazione della memoria immunologica. Nel contesto delle malattie croniche in cui il carico di antigene è continuo, ex vivo risposte valuteranno le risposte delle cellule effettrici o una combinazione di memoria e cellulari effettrici risposte. Il lungo termine colta-IFN γ ELISPOT test, descritto qui, probabilmente consente di misurare le risposte Tcm piuttosto che delle cellule T effettrici o combinate le risposte delle cellule T CD4 +. In sintesi, a lungo termine coltura-IFN γ ELISPOT analisi fornisce un valido approccio per stimare risposte memoria delle cellule T ed è stato impiegato con successo per valutare le risposte di memoria di diverse specie a una varietà di agenti infettivi, 12-16, 20-25,29 , 31,33,34,38,39.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

La ricerca è stata sostenuta da USDA, ARS Cris: 3625-32000-104 e Agriculture and Food Initiative Research Grant competitivo no. 2011-67015-30736 dal National Institute USDA di alimentazione e l'agricoltura. Ringraziamo Jessica Pollock, Emma Frimml-Morgan, Shelly Zimmerman, Kristin Basso, Bruce Pesch, Molly Stafne, Allen Jensen, e Tracy Porter per la loro assistenza tecnica eccellente, così come Rebecca Madison, Doug Ewing, Katie Pille, Jay Steffen, David Lubbers , Robin Zeisness, e David Panthen per l'ottima cura e la gestione degli animali.

Materials

Sodium citrate (dihydrate) Various
Citric acid (monohydrate) Various
Dextrose Various
ELISPOT PVDF plate Various
Vectastain ABC – AP KIT Standard Vector Laboratories AK-5000
Vector Blue Alkaline Phosphatase Substrate Kit Vector Laboratories SK-5300
Ag85A Lionex LRP-0004.3 23, 24, 25, 37
TB 10.4 Lionex LRP-0061.6 23, 24, 25, 37
PPDb Prionics AG 7600055
rESAT-6:CFP10 Kind gift Dr. Minion, Iastate 23, 24, 25, 27,  37
Mouse anti-bovine IFN-γ Clone CC302 Serotec MCA1783B 23, 24, 25, 27,  37
Mouse anti-bovine IFN-γ Biotinylated Clone CC330 Serotec MCA2112 23, 24, 25, 27,  37
Mouse anti-bovine CD4 Clone CC8 Serotec MCA1653GA
Mouse anti-bovine CD45RO Clone IL116A Serotec MCA2434GA
Rat anti-human CCR7 Clone 3D12 Abcam ab95665
Mouse anti-bovine IFN-γ-Pe Clone CC302 Serotec MCA1783PE
Goat anti- mouse IgG2a- Alexa Fluor 350 Invitrogen A-21130
Goat anti-mouse IgG3 APC-CY7 SouthernBiotechnology 1080-193
Goat anti-rat IgG-APC Invitrogen A10540
BD Cytofix/Cytoperm™ BD Biosciences 554714
BrefeldinA Sigma-Aldrich B7651
Pokeweed Mitogen Sigma-Aldrich L8777
Recombinat human Interleukin 2 Sigma-Aldrich I7908
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Maggioli, M. F., Palmer, M. V., Vordermeier, H. M., Whelan, A. O., Fosse, J. M., Nonnecke, B. J., Waters, W. R. Application of Long-term cultured Interferon-γ Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle. J. Vis. Exp. (101), e52833, doi:10.3791/52833 (2015).
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