정렬 된 불멸화 된 B 세포로부터 재조합 인간 IgG 단일 클론 항체의 생성
Summary
Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.
Abstract
Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.
Introduction
이 문서의 목적은 구체적으로 생성하여 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에서 얻은 인간 IgG 단일 클론 항체를 특성화하는 방법을 설명하기위한 것이다.
인간 항체를 연구 관심은 연구의 다양한 분야에서 성장했다. 특히, 많은 연구 그룹들은 자동 항체 1-3로 인한 병리학에 관심을 갖고있다. 우리는 복제 및 병원성 자동 항체 1을 특징으로했다. 자동 항체의 연구는 경쟁 항체 (4)를 사용하여, 예를 들어, 자신의 목표를 확인하고 치료 전략을 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한, 인간 항체의 연구는 또한, 백신 접종 5 이후에 면역 반응을 평가하기 위해 노출 및 특정 병원균 6 공부 내성되었다 된 개인의 항체 프로파일을 특성화하기 위해, 즉, 다른 연구 분야에서 관심을 가질 수있는 항체에자연 레퍼토리 7,12.
몇 가지 기술은 재조합 인간 단일 클론 항체 8-12를 생성하기 위해 개발되어왔다; 이들의 대부분은 파지 디스플레이와 B 세포의 불멸화를 사용한다. 파지 디스플레이의 사용은 광범위하게 새로운 항체 (13)의 발견에 적용되어왔다. 그러나 그것은가 인간 면역 글로불린의 중쇄 및 경쇄 쌍 프로세스 해리 즉 있다는 큰 단점을 갖는다. 인간 B 세포 또는 EBV 변환과 하이 브리 도마의 생산은 이러한 단점을 극복한다.
우리는 수신자 같은 수용체 9 (TLR-9)를 통해 6,12 폴리 클로 날 B 세포 자극과 조합 EBV B와 흉선 세포의 감염을 사용한다.
본 논문에서는 구체적으로 우리가 시험 관내 항체 생성에 PBMC 분리의 모든 단계의 전체 개요, IgG의 인간 항체의 개발을 위해 사용하는 기술에 대해 설명합니다. 이프로토콜은 인간 IgG 프로파일의 임의의 유형의 분석에 이용 될 수있다. 실험실에서의 IgG 항체를 생산하는 B 세포는 PBMC를 성공적으로 분류 한 후 나머지로부터 분리되었다. 쉰 정렬 B 세포 8은 멀티 웰 플레이트에 도금 단일 B 세포의 클로 날 팽창을 위해, EBV 및 TLR-9를 활성화하여 불멸화 될 수있다. 피더 세포로서 인간 배아 폐 조직으로부터 섬유 아세포, 불멸화 B 세포의 가시화를 용이 세포주 WI38을 사용되었다. 이러한 B 세포에서의 면역 글로불린 중쇄 및 경쇄 서열을 PCR에 의해 수득 될 수 있고, 항체 '유전자는 면역 글로불린 G 발현 벡터에 클로닝하고 시험 관내에서 생산. 이 기술을 사용하여, 도너 검색된 정확히 같은 단일 항체 서열과 항체를 연구 할 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 논문에서는, 인간 PBMCs를으로부터의 IgG 항체의 생성을위한 모든 단계가 상세하게 제시된다. 이 프로토콜은 이전에 발행 된 기술에 비해 몇 가지 장점을 포함하고 있습니다. 장점 중 하나는 생성 된 항체는 B 세포 클론 원래 쌍에 대응하는 중쇄 및 경쇄를 유지한다는 것이다. IgG의 항체의 확인은 인간 공여자의 어떤 유형으로 수행 될 수 있으며, 백신 접종 5에 의한 면역 반응의 악화가 필…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
에 연구 계약 미구엘 세르 베트 (ISCIII CD14 / 00,032) (GN-G.). 에 과학 연구 "번역 상 신경 과학 프로그램의 대학원"에 대한 네덜란드기구 (022,005,019) (CH)에서 원정대.
Prinses 베아트릭스 퐁 (프로젝트 WAR08-12) 및 협회 프랑세즈 contre 레 근육 병증에에서 보조금 (PM-M.) 뿐만 아니라 과학 연구에 대한 네덜란드기구의 왔노 원정대 (916.10.148) 네덜란드의 뇌 재단의 교제로 (FS2008 (1) -28)와 ML에 Prinses 베아트릭스 퐁 (프로젝트 WAR08-12) ( ).
우리는 유동 세포 계측법에 의해 정렬 B 세포에있는 그녀의 도움을 Jozien 야스퍼스 감사합니다.
Materials
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | solution containing polysucrose and sodium diatrizoate |
| FACSAria II cell sorter | BD Biosciences | ||
| 96 U-bottom micro well plates | Costar | 3799 | |
| Advanced Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco, Life Technologies | 12633-020 | |
| 30% v/v EBV-containing supernatant of the B95-8 cell line | ATCC | CRL-1612 | 3.4 x 108 copies/ml |
| CpG2006 | Invivogen | ODN 7909 | |
| Wi38 cells | Sigma-Aldrich | 90020107 | |
| Interleukin-2 | Roche | 10799068001 | |
| ELISA plates | Greiner Bio-One, Microlon | 655092 | |
| AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific (unconjugated) | Jackson ImmunoResearch | 109-006-008 | |
| 4% non-fat dry milk (Blotting Grade Blocker) | Biorad | 170-6404 | |
| Human IgG | Sigma | I 2511 | HUMAN IgG purified Immunoglobulin, 5.6 mg/ml |
| Goat F(ab)2 antihuman IgG Fcγ (conjugated with peroxidase (PO)) | Jackson ImmunoResearch | 109-036-008 | |
| ELISA reader (Perkin Elmer 2030) | Perkin Elmer | 2030-0050 | |
| Peroxidase-conjugated AffiniPure Rabbit Anti-Human IgM, Fc5µ | Jackson ImmunoResearch | 309-035-095 | |
| SuperScript III Cells Direct cDNA Synthesis System | Invitrogen | 18080-200 | |
| Applied Biosystems (ABI) GeneAm PCR System 2700 | Applied Biosystems | ||
| High Pure RNA Isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
| Reverse transcription system kit | Promega | A3500 | |
| Recombinant Taq DNA Polymerase | TAKARA | R001A | |
| Primers (2μl) | Sigma | ||
| Ultrapure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| 100 bp ladder | Invitrogen | 15628-019 | |
| Quantity One 4.5.2 (Gel Doc 2000) | Biorad | 170-8100 | |
| QIAquick PCR purification kit | QIAGEN | 28106 | |
| BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit | Applied Biosystems | 4337455 | |
| 0.1 ml reaction plate (MicroAMP Optical 96-well) | Applied Biosystems | 4346906 | |
| Genetic analyser ABI300 | Applied Biosystems | 4346906 | |
| DH5α competent cells (E. coli) | Invitrogen | 18263-012 | |
| pFUSEss-CHIg-hG1 (4493 bp) | Invivogen | pfusess-hchg1 | |
| pFUSEss-CHIg-hG4 (4484 bp) | Invivogen | pfusess-hchg4 | |
| pFUSE2ss-CLIg-hk (3875 bp) | Invivogen | pfuse2ss-hclk | |
| pFUSE2ss-CLIg-hl2 (3883 bp) | Invivogen | pfuse2ss-hcll2 | |
| SOC medium | Invitrogen | 15544-034 | |
| LB-based agar medium supplemented with Zeocin (Fast-Media Zeo Agar) | Invivogen | fas-zn-s | |
| Terrific Broth (TB)-based liquid medium supplemented with Zeocin (Fast-Media Zeo TB) | Invivogen | fas-zn-l | |
| DNA Miniprep kit | Omega Bio Technology | D6942-02 | |
| Nanodrop (ND1000 Spectrophotometer) | Nanodrop | ||
| LB-based agar medium supplemented with Blasticidin (Fast-Media Blast Agar) | Invivogen | fas-bl-s | |
| Terrific Broth (TB)-based liquid medium supplemented with Blasticidin (Fast-Media Blast TB) | Invivogen | fas-bl-l | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | 20,000 U/ml, in 10x NEBuffer EcoRI |
| NheI | New England Biolabs | R0131S | 10,000 U/ml, in 10x NEBuffer 2.1 |
| 2-Log DNA ladder | New England Biolabs | N3200S | 0.1-10.0 kb, 1,000 μg/ml |
| XmaI | New England Biolabs | R0180S | 10,000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer |
| BsiWI | New England Biolabs | R0553S | 10,000 U/ml, in 10x NEBuffer 3.1 |
| AvrII | New England Biolabs | R0174S | 5,000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer |
| FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase | Thermo Scientific | EF0651 | 1 U/µL, in 10x FastAP Buffer |
| DH5α competent cells | Invitrogen | 18263-012 | |
| PE Mouse Anti-Human IgG | BD Pharmingen | 555787 | |
| anti-CD22, PerCP-Cy5.5, Clone: HIB22 | Fisher scientific | BDB563942 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | |
| BigDye Terminator v3.1 | Applied Biosystems | 4337455 |
Riferimenti
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