Erzeugung von rekombinanten humanen IgG monoklonalen Antikörpern aus Immortalisierte Sortiert B Cells
Summary
Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.
Abstract
Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.
Introduction
Das Ziel dieses Artikels ist, im Detail zu beschreiben eine Methode zur Erzeugung und Charakterisierung human IgG monoklonaler Antikörper aus humanen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) erhalten.
Das Interesse für die menschliche Antikörper zu untersuchen hat in vielen Bereichen der Forschung gewachsen. Insbesondere sind viele Forschungsgruppen Interesse in der Pathologie von Autoantikörpern verursacht 1-3. Wir kloniert und charakterisiert pathogene Autoantikörper 1. Die Studie von Autoantikörpern kann helfen, ihre Ziele zu identifizieren und therapeutische Strategien zu entwickeln, beispielsweise unter Verwendung von Antikörpern Wettbewerber 4. Außerdem kann die Untersuchung der menschlichen Antikörper auch von Interesse in anderen Forschungsgebieten, dh, um die Immunantwort nach der Impfung 5 zu bewerten, um die Antikörperprofil von Individuen, die belichtet und wurde resistent gegen bestimmte Krankheitserreger 6 bzw. zu untersuchen, wurden die kenn Antikörper sind indas natürliche Repertoire 7,12.
Verschiedene Techniken sind entwickelt worden, um rekombinante menschliche monoklonale Antikörper 8-12 zu erzeugen; die meisten von ihnen verwenden, Phagen-Display und B-Zell-Immortalisation. Die Verwendung von Phagen-Display wurde ausgiebig für die Entdeckung von neuen Antikörpern 13 angelegt. Es hat jedoch einen großen Nachteil, nämlich, daß die schweren und leichten Kettenpaaren des menschlichen Immunglobulins werden in dem Verfahren dissoziiert. Herstellung von Hybridomen mit menschlichen B-Zellen oder EBV-Transformation überwindet diesen Nachteil.
Wir verwenden Infektion von Thymus-B-Zellen mit EBV in Kombination mit polyklonalen B-Zell-Stimulation über Toll-like Rezeptor 9 (TLR-9) 6,12.
In diesem Papier beschreiben wir ausführlich die Technik, die wir für die Entwicklung von menschlichen Antikörpern IgG, mit einem kompletten Überblick über alle Schritte von PBMC Isolierung auf die In-vitro-Antikörpern. DieseProtokoll für die Analyse von jeder Form von menschlichem IgG-Profil verwendet werden. In unserem Labor, B-Zellen, die IgG-Antikörper wurden erfolgreich aus dem Rest der PBMCs nach der Sortierung getrennt. Fünfzig sortiert B-Zellen 8 kann dann in Multiwell-Platten plattiert und mit EBV immortalisiert und TLR-9-Aktivierung, die klonale Expansion von einzelnen B-Zellen sein. Als Feeder-Zellen, Fibroblasten aus menschlichen embryonalen Lungengewebe verwendet wurden, Zellinie WI38, die die Visualisierung der immortalisierten B-Zellen ermöglicht. Von diesen B-Zellen, können die Sequenzen der schweren und leichten Ketten des Immunglobulins durch PCR erhalten werden, und der Antikörper-Gene in Immunglobulin-G-Expressionsvektoren kloniert und in vitro produziert. Mit dieser Technik können einzelne Antikörper mit genau der gleichen Antikörpersequenz in dem Spender gefunden sucht werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Manuskript, werden alle Schritte für die Erzeugung von IgG-Antikörpern aus humanen PBMCs im Einzelnen dargestellt. Dieses Protokoll umfasst einige Vorteile gegenüber zuvor veröffentlichten Verfahren. Einer der Vorteile ist, dass die produzierten Antikörpers behält die schweren und leichten Ketten der Vorlage entsprechende Paar in der B-Zell-Klon. Die Identifizierung von IgG-Antikörpern kann in jeder Art von menschlichen Spender durchgeführt werden und es besteht keine Notwendigkeit für Exazerbation de…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forschungsvertrag Miguel Servet (ISCIII CD14 / 00032) bis (GN-G.). Stipendium der niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung "Graduate School of Translational Neuroscience Program" (022005019) an (CH).
Zuschüsse aus dem Prinses Beatrix Fonds (Projekt WAR08-12) und der Association Française contre les Myopathien zu (PM-M.); sowie durch eine Veni Fellowship der Niederlande Organisation für wissenschaftliche Forschung (916.10.148) ein Stipendium des Gehirns Foundation der Niederlande (FS2008 (1) -28) und dem Prinses Beatrix Fonds (Projekt WAR08-12) (ML ).
Wir danken Jozien Jaspers für ihre Hilfe in der B-Zellsortierung mittels Durchflusszytometrie.
Materials
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | solution containing polysucrose and sodium diatrizoate |
| FACSAria II cell sorter | BD Biosciences | ||
| 96 U-bottom micro well plates | Costar | 3799 | |
| Advanced Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco, Life Technologies | 12633-020 | |
| 30% v/v EBV-containing supernatant of the B95-8 cell line | ATCC | CRL-1612 | 3.4 x 108 copies/ml |
| CpG2006 | Invivogen | ODN 7909 | |
| Wi38 cells | Sigma-Aldrich | 90020107 | |
| Interleukin-2 | Roche | 10799068001 | |
| ELISA plates | Greiner Bio-One, Microlon | 655092 | |
| AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific (unconjugated) | Jackson ImmunoResearch | 109-006-008 | |
| 4% non-fat dry milk (Blotting Grade Blocker) | Biorad | 170-6404 | |
| Human IgG | Sigma | I 2511 | HUMAN IgG purified Immunoglobulin, 5.6 mg/ml |
| Goat F(ab)2 antihuman IgG Fcγ (conjugated with peroxidase (PO)) | Jackson ImmunoResearch | 109-036-008 | |
| ELISA reader (Perkin Elmer 2030) | Perkin Elmer | 2030-0050 | |
| Peroxidase-conjugated AffiniPure Rabbit Anti-Human IgM, Fc5µ | Jackson ImmunoResearch | 309-035-095 | |
| SuperScript III Cells Direct cDNA Synthesis System | Invitrogen | 18080-200 | |
| Applied Biosystems (ABI) GeneAm PCR System 2700 | Applied Biosystems | ||
| High Pure RNA Isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
| Reverse transcription system kit | Promega | A3500 | |
| Recombinant Taq DNA Polymerase | TAKARA | R001A | |
| Primers (2μl) | Sigma | ||
| Ultrapure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| 100 bp ladder | Invitrogen | 15628-019 | |
| Quantity One 4.5.2 (Gel Doc 2000) | Biorad | 170-8100 | |
| QIAquick PCR purification kit | QIAGEN | 28106 | |
| BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit | Applied Biosystems | 4337455 | |
| 0.1 ml reaction plate (MicroAMP Optical 96-well) | Applied Biosystems | 4346906 | |
| Genetic analyser ABI300 | Applied Biosystems | 4346906 | |
| DH5α competent cells (E. coli) | Invitrogen | 18263-012 | |
| pFUSEss-CHIg-hG1 (4493 bp) | Invivogen | pfusess-hchg1 | |
| pFUSEss-CHIg-hG4 (4484 bp) | Invivogen | pfusess-hchg4 | |
| pFUSE2ss-CLIg-hk (3875 bp) | Invivogen | pfuse2ss-hclk | |
| pFUSE2ss-CLIg-hl2 (3883 bp) | Invivogen | pfuse2ss-hcll2 | |
| SOC medium | Invitrogen | 15544-034 | |
| LB-based agar medium supplemented with Zeocin (Fast-Media Zeo Agar) | Invivogen | fas-zn-s | |
| Terrific Broth (TB)-based liquid medium supplemented with Zeocin (Fast-Media Zeo TB) | Invivogen | fas-zn-l | |
| DNA Miniprep kit | Omega Bio Technology | D6942-02 | |
| Nanodrop (ND1000 Spectrophotometer) | Nanodrop | ||
| LB-based agar medium supplemented with Blasticidin (Fast-Media Blast Agar) | Invivogen | fas-bl-s | |
| Terrific Broth (TB)-based liquid medium supplemented with Blasticidin (Fast-Media Blast TB) | Invivogen | fas-bl-l | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | 20,000 U/ml, in 10x NEBuffer EcoRI |
| NheI | New England Biolabs | R0131S | 10,000 U/ml, in 10x NEBuffer 2.1 |
| 2-Log DNA ladder | New England Biolabs | N3200S | 0.1-10.0 kb, 1,000 μg/ml |
| XmaI | New England Biolabs | R0180S | 10,000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer |
| BsiWI | New England Biolabs | R0553S | 10,000 U/ml, in 10x NEBuffer 3.1 |
| AvrII | New England Biolabs | R0174S | 5,000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer |
| FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase | Thermo Scientific | EF0651 | 1 U/µL, in 10x FastAP Buffer |
| DH5α competent cells | Invitrogen | 18263-012 | |
| PE Mouse Anti-Human IgG | BD Pharmingen | 555787 | |
| anti-CD22, PerCP-Cy5.5, Clone: HIB22 | Fisher scientific | BDB563942 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | |
| BigDye Terminator v3.1 | Applied Biosystems | 4337455 |
Riferimenti
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