Neuronale Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Serum-freiem Monolayer-Kultur
Summary
This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.
Abstract
Die Fähigkeit, embryonalen Stammzellen der Maus zu differenzieren (ESC) zu neuralen Vorläuferzellen ermöglicht die Untersuchung der Mechanismen, die neuronale Spezifikation sowie die Erzeugung von reifen neuralen Zelltypen für eine weitere Studie. In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode zur Unterscheidung von ESC zu neuralen Vorläuferzellen mit Serum-freien, Monokultur. Das Verfahren ist skalierbar, effizient und führt zur Produktion von ~ 70% neuralen Vorläuferzellen innerhalb 4-6 Tagen haben. Es kann zu ESC aus verschiedenen Stämmen unter einer Vielzahl von Bedingungen gewachsen angewendet werden. Neuralen Vorläuferzellen kann zugelassen werden, um weiter in funktionelle Neuronen und Glia differenzieren oder analysiert durch Mikroskopie, Durchflusszytometrie oder molekularen Techniken. Der Differenzierungsprozess zugänglich ist Zeitraffermikroskopie und kann mit der Verwendung von Reporter-Linien, um die neuronale Spezifikationsprozess Überwachung kombiniert werden. Wir bieten Ihnen detaillierte Anweisungen, Medienaufbereitung und Zelldichte-Optimierung, damit der Prozess zu be angelegt, um die meisten ESC Leitungen und einer Vielzahl von Zellkulturgefäßen.
Introduction
Embryonale Stammzellen sind pluripotente Zellen des frühen Embryos mit der Fähigkeit, auf unbestimmte Zeit in vitro proliferieren, abgeleitet, während die Fähigkeit beibehalten wird (durch Bildung einer Chimäre) in alle adulten Zelltypen folgenden Wiedereinführung in einem geeigneten Stadium Embryos differenzieren, die Injektion in syngene oder immunsupprimierten (durch Bildung einer Teratom) oder in vitro unter Umständen von Cues 1. Die in vitro Differenzierung von embryonalen Maus-Stammzellen zu neuralen Linien wurde erstmals 1995 beschrieben und involviert die Bildung von vielzelligen Aufhängung Aggregate (Embryoid Bodies, EBs) in serumhaltigem Medium mit dem Morphogen Retinsäure 2-4 ergänzt. Seitdem wurde eine Vielzahl von Protokollen entwickelt, die neuronale Differenzierung 5 ermöglichen. Viele noch zu nutzen Aggregation, andere Co-Kultur mit Zelltypen induzieren und mehrere beinhalten die Verwendung von Serum-freien Medien. Alle Protokolle haben Vorteile einnd Nachteile und die genaue Art der neuronalen oder neuronalen Zellen produziert auch variiert in Abhängigkeit von dem verwendeten Protokoll.
Die ideale Protokoll wäre robust, skalierbar und nutzen vollständig definierten Medien und Substrate, sei zugänglich nicht-invasive Überwachung des Differenzierungsprozesses und führen zu der Erzeugung von reinen Populationen von neuronalen Vorläuferzellen in der Lage, durch externe Signale und zur Differenzierung strukturiert werden in allen neuronalen und glialen Subtypen mit hoher Effizienz und Ausbeute in einer relativ kurzen Zeit. In den letzten zehn Jahren haben wir mit Hilfe wurde ein Verfahren zur Erzeugung von neuralen Vorläuferzellen und Neuronen aus Maus ESC in einer niedrigen Dichte, Serum-freien anhaftenden Monolayer-Kultur 6-10. Dieses Protokoll erfüllt viele der oben genannten Kriterien: in unseren Händen die Effizienz der Differenzierung hat ganz konsequent über viele Jahre und eine Vielzahl von Zelllinien wurde, kann nach oben oder unten skaliert werden (wir erfolgreich Schiffe aus Platten mit 96 Vertiefungen zu 15 cm Durchmesser dishes) und die verwendeten Medien sind gut definiert. Das Verfahren ist offen für Zeitraffermikroskopie zur Überwachung der Differenzierung und einer Vielzahl von Strukturierungs Signale hinzugefügt werden, um die Erzeugung von verschiedenen Typen von neuronalen Subtypen (zB Shh und Fgf8 für dopaminerge Neuronen 6) zu induzieren.
Dennoch gibt es einige Probleme bezüglich der erfolgreichen Anwendung dieses Protokolls. Einer der wichtigsten Aspekte ist eine sorgfältige Vorbereitung der Medien. Wir bereiten immer die Medien im Haus trotz der Verfügbarkeit von kommerziellen Alternativen. Eine der verwendeten Ergänzungsmittel (N2; siehe Protocol) hat Änderungen gegenüber dem handelsüblichen Fassungen. Schließlich ist einer der wichtigsten Schritte für die erfolgreiche Anwendung dieses Verfahrens die optimale Zelldichte bei der Galvanisierung. Dies liegt hauptsächlich daran, während der autokrinen Natur eines der Induktion Signale (FGF4 11) erfordert, dass genügend Zellen vorhanden, um eine optimale viabil ermöglichen, sindkeit und Differenzierung, bei zu hohen Dichten Differenzierung (aufgrund autokrine Produktion von LIF 12 ggf. teilweise) beeinträchtigt. Es ist daher wichtig, dass die beiden Medienherstellung und Zell Plattierung sorgfältig durchgeführt und konstant, um optimale Ergebnisse sicherzustellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Monoschicht neuronalen Differenzierung Protokoll wird seit mehr als einem Jahrzehnt 6 gewesen. Das Protokoll ist sehr leistungsfähig, von definiertem Medium zusammengesetzt ist und in einer Monoschicht-System, das das System eher für präklinische macht gemacht (zB Arzneimittel-Screening) verwendet. Es gibt jedoch einige wichtige Faktoren, die die Differenzierung Effizienz zu bestimmen. Dieser Artikel weist darauf hin, die Faktoren und die Lösung für jedes Hindernis.
<p class="jove_conten…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Work was funded by a Development and Promotion of Science and Technology scholarship from the Thai Ministry for Education to W.W. and grants from Tenovus and the Anonymous Trust to M.P.S.
Materials
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320-074 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A11105-01 | |
| B-27 Supplement, serum free | Life Technologies | 17504-044 | |
| Insulin | Sigma | I6634 | Reconstitute with sterile 0.01M HCl |
| Apo-transferrin | Sigma | T1147 | Reconstitute with sterile water |
| Progesterone | Sigma | P8783 | Reconstitute with ethanol |
| Putrescine | Sigma | P5780 | Reconstitute with sterile water |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | Reconstitute with sterile water |
| Bovine albumin fraction V | Life Technologies | 15260-037 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Make sure it is completely dissolved before use as glutamine is usually sedimented |
| Gelatine | Sigma | G1890 | |
| 6-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 140675 | |
| 24-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 142475 | |
| 96-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 167008 | |
| GMEM | Life Technologies | 11710-035 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| MEM Non-essential amino acids solution | Life Technologies | 11140-050 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Leukaemia inhibitory factor | prepared in-house as in Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma | D9542 | Protect from light |
| Mouse anti betaIII tubulin IgG antibody | Covance | MMS-435P | |
| Fluorescence-labelled anti-Mouse IgG antibody | Life Technologies | A31571 | Protect from light |
| 25cm2 tissue culture flask | Thermo Scientific | 156367 | |
Riferimenti
- Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 435-462 (2001).
- Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).
- Fraichard, A., et al. In vitro. differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. J. Cell Sci. 108, 3181-3188 (1995).
- Strubing, C., et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into the neuronal lineage in vitro gives rise to mature inhibitory and excitatory neurons. Mech. Dev. 53, 275-287 (1995).
- Stavridis, M. P., Smith, A. G. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biochem Soc Trans. 31, 45-49 (2003).
- Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat Biotechnol. 21, 183-186 (2003).
- Ying, Q. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
- Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification. Development. 134, 2889-2894 (2007).
- Stavridis, M. P., Collins, B. J., Storey, K. G. Retinoic acid orchestrates fibroblast growth factor signalling to drive embryonic stem cell differentiation. Development. 137, 881-890 (2010).
- Speakman, C. M., et al. Elevated O-GlcNAc Levels Activate Epigenetically Repressed Genes and Delay Mouse ESC Differentiation Without Affecting Naive to Primed Cell Transition. Stem Cells. 32, 2605-2615 (2014).
- Kunath, T., et al. FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment. Development. 134, 2895-2902 (2007).
- Dani, C., et al. Paracrine induction of stem cell renewal by LIF-deficient cells: a new ES cell regulatory pathway. Dev Biol. 203, 149-162 (1998).
- Smith, A. G. Culture and differentiation of embryonic stem cells. Journal of Tissue Culture Methods. 13, 89-94 (1991).
- Aubert, J., et al. Screening for mammalian neural genes via fluorescence-activated cell sorter purification of neural precursors from Sox1-gfp knock-in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 11836-11841 (2003).
- Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3. Genes Dev. 12, 2048-2060 (1998).
- Silva, J., Smith, A. Capturing pluripotency. Cell. 132, 532-536 (2008).
