Лечение тромбоцитов Продукты с рибофлавин и УФ света: эффективность против высокий титр бактериального загрязнения
Summary
The storage conditions of platelet products create an ideal environment for bacterial contaminants to multiply to dangerous levels. The goal of this study was to use a colony forming assay to evaluate a riboflavin based pathogen reduction process against high titer bacterial contamination in human platelet products.
Abstract
Загрязнение единиц тромбоцитов бактериями уже давно признан в качестве существенного риска переливания из-за условий их хранения после пожертвования. Продукты хранятся обычно при 22 ° С на шейкере с перемешивающим, условие, которое может способствовать росту бактерий. Хотя общее число бактерий, как полагают, быть введены в продукт тромбоцитов чрезвычайно низка, эти бактерии могут размножаться в очень высоким титром перед переливанием, что потенциально приводит к серьезных побочных эффектов. Целью данного исследования было оценить рибофлавин основе процесс сокращения патогенов против панели бактерий, которые были определены как общие загрязняющих веществ продуктов тромбоцитов. Эта панель включает следующие организмы: С. эпидермальный стафилококк, С., С. Mitis, С. Пирролидонилпептидаза, С. Ю. marcescens, энтероколитные, Б. neotomae, Б. CEREUS, кишечной палочки, синегнойной и K. пневмонии. Каждый блок тромбоцитов инокулировали с высокой бактериальной нагрузки и отбирали пробы бдр до и после лечения. Колония формирования анализа, используя схему разведения конечной точки, был использован для определения предварительной обработки и после лечения бактериальных титров. Снижение Войти была рассчитывается путем вычитания после лечения титр от титра до лечения. Были отмечены следующие сокращения журнала: С. эпидермальный 4,7 журнала (99,998%), золотистого стафилококка 4,8 журнала (99,998%), С. Mitis 3,7 журнала (99,98%), С. Пирролидонилпептидаза 2.6 Журнал (99,7%), С. marcescens 4,0 журнала (99,99%), Ю. энтероколитные 3.3 Журнал (99,95%), Б. neotomae 5.4 Журнал (99,9996%), Б. эхиноцереус 2.6 Журнал (99,7%), кишечная палочка ≥5.4 журнала (99,9996%), П. палочки 4,7 журнала (99,998%) и К , пневмонии 2,8 лог (99,8%). Результаты этого исследования предполагают, что процесс может помочь снизить риск серьезных побочных эффектов, связанных с переливания бактериального загрязнения.
Introduction
Переливание тромбоцитов, плазмы, эритроцитарной массы и целые продукты крови играют важную роль в современной медицине и может быть использовано для лечения различных заболеваний, заменить жизненно важных жидкостей и в конечном итоге спасти жизнь. Тромбоциты сотовый продукт, который либо изолирован от цельной крови и объединяли в transfusable дозы или собраны в процессе тромбоцитов афереза. Основная роль тромбоцитов в организме, чтобы остановить кровотечение при ранении сайтов и, чтобы помочь сохранить гемостаза. Пациенты, страдающие от низкой тромбоцитов клеток (тромбоцитопения) восприимчивы к спонтанных кровотечений и переливание тромбоцитов довести их тромбоцитов клеток рассчитывать обратно в пределах нормы. Собранные тромбоциты хранятся в течение максимум 5-7 дней и хранят при 22 ± 2 ° С при при постоянном перемешивании.
Несмотря на спасательные свойства переливания тромбоцитов остается незначительную опасность для получателей переливания из-за сотрудничестваntamination из этих продуктов паразитами, бактериями и вирусами 11. Реализация вирусной тестирования нуклеиновых кислот (NAT) значительно снижает риск передачи вируса от крупных кровеносных иметь агентов, таких как вирусом гепатита С (HCV), вируса гепатита В (HBV) и вирусом человеческого иммунодефицита (ВИЧ) 5. В недавней публикации из канадских крови услуги оценивает остаточный риск для этих агентов, чтобы быть 1 за 8 миллионов пожертвований на ВИЧ, 1 за 6,7 млн пожертвований для ВГС и 1 за 1,7 млн пожертвований для ВГВ 15.
Хотя бактерии, как правило, собрать меньше внимания в широкой общественности, частота бактериального загрязнения в продуктах тромбоцитов, по оценкам, будет выше, чем 1: 1000 7 и потому, что миллионы продуктов тромбоцитов переливается каждый год многие получатели подвергаются потенциально угрожающих жизни осложнений как сепсис 6. Исследования показывают, что бактериальная нагрузка в моментзагрязнения низкий, <100 колониеобразующих единиц (КОЕ) / продукта 2,16, однако питательная среда для хранения и температуры в помещении позволяет загрязнять бактерии размножаться опасно высокие титры перед переливанием. В настоящее время только разрешенных методов, доступных для предотвращения бактериально загрязненных продуктов от достижения получателя тромбоцит посредством использования культуры на основе систем и быстрого точки ухода испытания. Вкратце, для культивирования на основе систем продукты тромбоцитов хранятся на мешалкой при 22 ° С в течение 12-24 ч, чтобы позволить бактерии размножаться в продукте, на котором образец 4-8 мл удалены из продукта тромбоцитов и инокулировали в колбу содержащий питательные среды. Бутылка помещается в инструмент, который контролирует бутылку для роста бактерий. Если прибор обнаруживает рост бактерий в бутылку она попадает и соответствующий блок тромбоцитов отбрасывается. Хотя этот процесс является достаточно успешным на выявление быстрый GROкрыло организмов, многие из медленно растущих видов не растут на достаточно высоком титре быть обнаружен, таким образом, создавая потенциал для ложноотрицательных подразделений, которые будут выпущены для переливания 7,12,14,16,22. В отличие от культуры систем обнаружения, быстрое точка тестирования ухода, как правило, осуществляется в конце срока хранения тромбоцитов при бактериальной нагрузки значительно увеличивается. Высшие титры требуется, так как точка испытаний по уходу за менее чувствительны, чем систем на основе культуры, и только надежно обнаруживать бактерии, как только они достигают титр ≥1 х 10 3 КОЕ / мл 17. Однако такие тесты могут предоставить результаты в течение 1 часа выборки. Изменчивость в исполнении этих испытаний привели к выпуску фальшивой отрицательной продукта, в результате чего роковую септический реакцию у реципиента 9.
Альтернативный способ борьбы с вопроса о бактериального загрязнения продуктов тромбоцитов через повседневного использования восстановительной возбудитель прокESS, которые могут инактивировать бактерии загрязняющих вместо пытаться их обнаружить. Использование рибофлавина в качестве фотосенсибилизатора, в сочетании с УФ-светом, как было показано, снижают инфекционность широкого спектра патогенных переносимых кровью загрязнений, включая бактерии 3,4,8,10,19-21 .В использованием рибофлавина и УФ свет для снижения количества болезнетворных микроорганизмов является нетоксичным и не оказывает мутагенного и рибофлавин и УФ света обработке компоненты, как было показано, чтобы быть безопасным для получателей переливания, а также для тех, обработки продуктов крови 18. Вкратце, рибофлавин молекулы могут связывать с нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) бактерий, паразитов, вирусов и любой ядросодержащих клеток (например, белые кровяные клетки). Воздействие УФ света активирует рибофлавин, вызывая химическое изменение функциональных групп нуклеиновых кислот (прежде всего гуанин оснований), таким образом предотвращая репликацию и / или транскрипцию нуклеиновой кислоты, оставляя организм инактивированный 13. Anucleated клетки, как пластиныпозволяет и эритроциты не зависит от химии рибофлавина из-за отсутствия нуклеиновой кислоты.
Предыдущая работа с рибофлавин и УФ технологии оценили выберите группу бактерий, используя экспериментальную конструкцию, предназначенную для имитации продукт тромбоцитов загрязненную с клинически значимой бактериальной нагрузки (<20 КОЕ / продукта) 8. Цель данного исследования заключалась в оценке рибофлавин и УФ света процесс против высоким титром бактериального загрязнения (> 1,0 х 10 5 КОЕ / мл) в продуктах, обработанных тромбоцитов в плазме для того, измерения общего бактериального потенциала сокращения системы. Основываясь на данных, собранных из hemovigilance исследованиях 1, панель общераспространенных грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов был выбран для оценки в этом исследовании, и включала в себя следующие виды: эпидермального стафилококка, золотистый стафилококк, стрептококк Mitis, Streptococcus Пирролидонилпептидаза, Serratia marcescens, Yersinia энтероколитные ,Brucella neotomae, Bacillus Cereus (вегетативная форма), Esherichia палочка, синегнойная палочка и клебсиелла пневмонии. Все организмы, кроме B. эхиноцереус, были получены из АТСС и приоритет был сделан на получение бактериальных штаммов, которые были определены как будучи изолированным от компонентов крови. Имени Б. эхиноцереус испытания в этом исследовании является клинической штамм, выделенный внутри от загрязненной продукции тромбоцитов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Бактериальный скрининга стало обычной практикой в учреждениях банков крови и в течение многих местах это служит в качестве основного метода, чтобы предотвратить переливание бактериально загрязненных тромбоцитов. Хотя бактериальный скрининг, как правило, запретов большинство быстрорастущих грамотрицательных бактерий, таких как S. marcescens, Е. палочка и Е. клоаки, она изо всех сил, чтобы обнаружить медленно растущие грамположительные бактерии, такие как S. стафилококк, стрептококки. и С. эпидермальный 8. К сожалению, эти три грамположительных бактерий вовлечены в свыше 50% всех зараженных единиц тромбоцитов и переливание продуктов, содержащих тромбоцитов эти три организмов привело к смертности пациентов 1.
Бактериальный скрининга зависит от бактериальной титра в тромбоцитов продукта, чтобы быть достаточно достаточно высокой, так что по крайней мере один организм содержится внутри типичного 4-8 мл пробы скрининга, Если бактериальная титр не достаточно высока для бактерия быть захвачены в объеме образца 4-8 мл, устройство неправильно помечен как отрицательный и он будет выпущен для переливания. Альтернативный подход к бактериальной скрининга может быть использовать активную процесс, который может быть выполнен на всех тромбоцитов единиц, и это может оказать загрязняющих организмов как нефункциональные.
В этом исследовании, высокие титры бактерий преднамеренно добавлены тромбоцитов единиц, чтобы проверить общую емкость снижение процесса восстановления света патогена рибофлавина и ультрафиолетового. Хотя бактериальной нагрузки испытания в этом исследовании значительно превышают те, которые обычно находятся в продуктах крови во время пожертвования, это исследование помогает продемонстрировать, что процесс рибофлавина и ультрафиолетового света может значительно снизить титр жизнеспособных бактерий в загрязненной блока тромбоцитов 2.6 до 5.4 журнал (снижение 99.7-99.9996% загрязняющих бактерий) (рис 2). Чтобы получить ACCURAте значение снижения журнала, важно, что оператор имеет хорошую технику вдоль асептического с точными навыков пипеток при выполнении бактериальных шаги титр. Неточное дозирование при выполнении серийных разведений может привести к накоплению ошибок, таким образом неточным измерением титра.
Данные, собранные в этом исследовании поддерживает предыдущую работу с рибофлавином и ультрафиолетового света, который бросил вызов систему против низкого уровня, клинически значимых бактериемия (<20 КОЕ / единицу). Предыдущий исследования был разработан, чтобы имитировать реальную клиническую событие загрязнения, и результаты показали рибофлавин и УФ-излучения был эффективен в предотвращении роста бактерий на 7-дневный срок хранения тромбоцитов. Моделирование на основе данных из предыдущего исследования предполагает, что текущие оценки риска бактериального загрязнения продуктов тромбоцитов может быть уменьшена на целых 98% от текущих уровней 8. Процесс свет рибофлавин и УФ выгодно бактериальной экранеING, которая только продемонстрировали 66% эффективность в обнаруживать бактериальные загрязняющие вещества в тромбоцитов единиц, когда оспаривается с клинически значимой бактериальной нагрузки 8.
Как и во всех технологиях, PRT лечение продуктов тромбоцитов, чтобы предотвратить осложнения, связанные с бактериально загрязненных единиц тромбоцитов имеет свои ограничения. Системы PRT не эффективны против бактериальных спор и не инактивируют эндотоксин, таким образом, даже если система PRT могут инактивировать высокие титры грамотрицательных бактерий остальные эндотоксина еще может вызвать септический шок у реципиента. PRT лучше всего проводить рано во время хранения, прежде чем бактерии могут распространяться с высокими титрами.
В заключение, как показано с помощью комбинации этих двух исследований, процесс рибофлавина и ультрафиолетового света является эффективным при снижении бактериальной нагрузки обеих грамотрицательных и грамположительных организмов и может предложить реальную альтернативу скрининга бактериальных. Регулярно treatinг тромбоцитов продукты с рибофлавином и УФ-света также имеет дополнительное преимущество снижения потенциальную передачу других передающихся через кровь агентов, таких как вирусы и паразиты.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Mirasol Illuminator | Terumo BCT | N/A | |
| Mirasol Treatment/Storage Bag | Terumo BCT | N/A | |
| Hematology Analyzer | Beckman-Coulter | Ac•T diff | |
| Blood Gas Analyzer | Siemens | RapidLab 1265 | |
| Sterile Docking Device | Terumo BCT | TSCD | |
| Platelet Incubator | Helmer | PC2200 | |
| Orbital Incubator Shaker | Lab-Line | 4628 | |
| Dry Incubator | Fisher | Iso-temp | |
| Class II A/B3 Biosafety Cabinet | Thermo-forma | 1286 | |
| Tubing Sealer | Sebra | Smart Sealer II | |
| Table Top Centrifuge | IEC | Centra GP8R | |
| 10 mL Syringe | BD | 309604 | |
| 30 mL Syringe | BD | 309650 | |
| 5 mL Dilution Tube | VWR | 211-0058 | |
| 50 mL Conical Tube | Corning | 430290 | |
| Micropipette | Gilson | P-200 | |
| Micropipette | Rainin | R-200 | |
| Repeat Pipette | Eppendorf | 4780 | |
| 1-200 µL Filter Tip | Costar | 4810 | |
| 25 mL Disposable Serrological Pipette | Costar | 4489 | |
| 5 mL Disposable Serrological Pipette | Costar | 4487 | |
| 35 mL 500 µM Riboflavin | Terumo BCT | 35 mL 500 µM | |
| Brucella Agar with 5% Horse Blood | BBL | 221547 | |
| Brain Heart Infusion | Teknova | B9993 | |
| Peptone Water | BD | 257087 | |
| Trypticase Soy Broth | BD | 299113 | |
| Trypticase Soy Agar | Remel | R01917 | |
| Heat Inactivated Horse Serum | Gibco | 26050 |
Riferimenti
- Brecher, M. E., Hay, S. N. Bacterial contamination of blood components. Clin. Microbiol. Rev. 18 (1), 195-204 (2005).
- Brecher, M. E., Holland, P. V., Pineda, A. A., Tegtmeier, G. E., Yomtovian, R. Growth of bacteria in inoculated platelets: implications for bacteria detection and the extension of platelet storage. Transfusion. 40 (11), 1308-1312 (2000).
- Cardo, L. J., et al. Pathogen inactivation of Leishmania donovani infantum in plasma and platelet concentrates using riboflavin and ultraviolet light. Vox Sang. 90 (2), 85-91 (2006).
- Cardo, L. J., Salata, J., Mendez, J., Reddy, H., Goodrich, R. Pathogen inactivation of Trypanosoma cruzi in plasma and platelet concentrates using riboflavin and ultraviolet light. Transfus. Apher. Sci. 37 (2), 131-137 (2007).
- Dodd, R. Y. Current viral risks of blood and blood products. Ann. Med. 32 (7), 469-474 (2000).
- Dodd, R. Y. Bacterial contamination and transfusion safety: experience in the United States. Transfus. Clin. Biol. 10 (1), 6-9 (2003).
- Dumont, L. J., et al. Screening of single-donor apheresis platelets for bacterial contamination: the PASSPORT study results. Transfusion. 50 (3), 589-599 (2010).
- Goodrich, R. P., Gilmour, D., Hovenga, N., Keil, S. D. A laboratory comparison of pathogen reduction technology treatment and culture of platelet products for addressing bacterial contamination concerns. Transfusion. 49 (6), 1205-1216 (2009).
- Greco-Stewart, V. S., et al. Serratia marcescens strains implicated in adverse transfusion reactions form biofilms in platelet concentrates and demonstrate reduced detection by automated culture. Vox Sang. 102 (3), 212-220 (2012).
- Keil, S. D., et al. Inactivation of Plasmodium spp. in plasma and platelet concentrates using riboflavin and ultraviolet light. Transfusion. 53 (10), 2278-2286 (2013).
- Kleinman, S., Chan, P., Robillard, P. Risks associated with transfusion of cellular blood components in Canada. Transfus. Med Rev. 17 (2), 120-162 (2003).
- Larsen, C. P., Ezligini, F., Hermansen, N. O., Kjeldsen-Kragh, J. Six years’ experience of using the BacT/ALERT system to screen all platelet concentrates, and additional testing of outdated platelet concentrates to estimate the frequency of false-negative results. Vox Sang. 88 (2), 93-97 (2005).
- Mundt, J. M., Rouse, L., Van den Bossche, J., Goodrich, R. P. Chemical and Biological Mechanisms of Pathogen Reduction Technologies. Photochem. Photobiol. , (2014).
- Murphy, W. G., et al. Screening platelet concentrates for bacterial contamination: low numbers of bacteria and slow growth in contaminated units mandate an alternative approach to product safety. Vox Sang. 95 (1), 13-19 (2008).
- Brien, S. F., et al. Current incidence and residual risk of HIV, HBV and HCV at Canadian Blood Services. Vox Sang. 103 (1), 83-86 (2012).
- Pearce, S., Rowe, G. P., Field, S. P. Screening of platelets for bacterial contamination at the Welsh Blood Service. Transfus. Med. 21 (1), 25-32 (2011).
- Ramirez-Arcos, S., Kou, Y., Perkins, H. Evaluation of a universal point-of-issue assay for bacterial detection in buffy coat platelet components. Vox Sang. 107 (2), 192-195 (2014).
- Reddy, H. L., et al. Toxicity testing of a novel riboflavin-based technology for pathogen reduction and white blood cell inactivation. Transfus. Med. Rev. 22 (2), 133-153 (2008).
- Ruane, P. H., et al. Photochemical inactivation of selected viruses and bacteria in platelet concentrates using riboflavin and light. Transfusion. 44 (6), 877-885 (2004).
- Tonnetti, L., Proctor, M. C., Reddy, H. L., Goodrich, R. P., Leiby, D. A. Evaluation of the Mirasol pathogen reduction technology system against Babesia microti in apheresis platelets and plasma. Transfusion. 50 (5), 1019-1027 (2010).
- Vanlandingham, D. L., et al. Photochemical inactivation of chikungunya virus in plasma and platelets using the Mirasol pathogen reduction technology system. Transfusion. 53 (2), 284-290 (2013).
- Walther-Wenke, G., et al. Monitoring bacterial contamination of blood components in Germany: effect of contamination reduction measures. Vox Sang. 100 (4), 359-366 (2011).
