Behandeling van bloedplaatjes Producten met riboflavine en UV-licht: Effectiviteit tegen hoge titer bacteriële besmetting
Summary
The storage conditions of platelet products create an ideal environment for bacterial contaminants to multiply to dangerous levels. The goal of this study was to use a colony forming assay to evaluate a riboflavin based pathogen reduction process against high titer bacterial contamination in human platelet products.
Abstract
Besmetting van bloedplaatjes eenheden door bacteriën is al lang erkend als een belangrijke transfusie risico als gevolg van hun post-donatie bewaarcondities. Producten worden routinematig bewaard bij 22 ° C op een schudder roeren, een aandoening die bacteriegroei bevorderen. Hoewel het totale aantal bacteriën verondersteld worden geïntroduceerd in een trombocytenproduct is extreem laag, kunnen deze bacteriën vermenigvuldigen tot hoge titer vóór transfusie, kunnen leiden tot ernstige bijwerkingen. Het doel van deze studie was om riboflavine techniek pathogenen reductieproces tegen een panel van bacteriën die zijn geïdentificeerd als voorkomende verontreinigingen van bloedplaatjesproducten evalueren. Dit paneel onder meer de volgende organismen: S. epidermidis, S. aureus, S. mitis, S. pyogenes, S. marcescens, Y. enterocolitica, B. neotomae, B. cereus, E. coli, P. aeruginosa en K. pneumoniae. Elke unit bloedplaatjes werd geïnoculeerd met een hoge bacteriologische belasting en monsters werden verwijderd both voor en na behandeling. Een kolonie vormende assay met behulp van een eindpunt verdunning schema werd gebruikt om de voorbehandeling en nabehandeling bacteriële titers te bepalen. Log vermindering werd berekend door de nabehandeling titer van de voorbehandeling titer. De volgende verminderingen log werden waargenomen: S. epidermidis 4,7 log (99,998%), S. aureus 4,8 log (99,998%), S. mitis 3,7 log (99,98%), S. pyogenes 2,6 log (99,7%), S. marcescens 4,0 log (99,99%), Y. enterocolitica 3,3 log (99,95%), B. neotomae 5,4 log (99,9996%), B. cereus 2,6 log (99,7%), E. coli ≥5.4 log (99,9996%), P. aeruginosa 4,7 log (99,998%) en K . pneumoniae 2,8 log (99,8%). De resultaten van deze studie suggereren dat de werkwijze zou kunnen helpen het risico van ernstige bijwerkingen transfusie geassocieerd met bacteriële contaminatie te verlagen.
Introduction
Transfusie van bloedplaatjes, plasma, verpakte rode bloedcellen en bloed producten spelen een belangrijke rol in de moderne geneeskunde en kan worden gebruikt voor de behandeling van diverse medische aandoeningen, vervangt vitale vloeistoffen en uiteindelijk levens redden. Bloedplaatjes zijn een cellulair product die ofwel geïsoleerd uit volbloed en samengevoegd in een transfusable dosis of worden verzameld door het proces van bloedplaatjes aferese. De belangrijkste rol van bloedplaatjes in het lichaam te stoppen met bloeden op wondplaatsen en om hemostase te handhaven. Patiënten die lijden aan een laag aantal bloedplaatjes cel (trombocytopenie) zijn spontaan bloeden gebeurtenissen en zijn transfusie met bloedplaatjes te brengen hun bloedplaatjes celgetal weer in een normale bereik. Verzamelde bloedplaatjes opgeslagen maximaal 5-7 dagen worden bewaard bij 22 ± 2 ° C terwijl constant werd geroerd.
Ondanks de levensreddende eigenschappen van bloedplaatjes transfusies is er een klein risico voor transfusie ontvangers als gevolg van co blijftntamination van deze producten met parasieten, bacteriën en virussen 11. De uitvoering van viraal nucleïnezuur test (NAT) is aanzienlijk verminderd risico van virusoverdracht grote bloed overdraagbare middelen, zoals hepatitis C virus (HCV), hepatitis B-virus (HBV) en humaan immunodeficiëntie virus (HIV) 5. Een recente publicatie van de Canadese Blood Services schat het resterende risico voor deze middelen zijn 1 per 8.000.000 donaties voor HIV, 1 per 6.700.000 donaties voor HCV en 1 per 1.700.000 donaties voor HBV 15.
Hoewel bacteriën Garner typisch minder aandacht in de bevolking, is de frequentie van bacteriële besmetting in trombocytenproducten geschat op zo hoog als 1: 1000 7 en door miljoenen bloedplaatjesproducten transfusie jaarlijks veel ontvangers blootgesteld aan potentieel levensbedreigende complicaties zoals sepsis 6. Uit onderzoek blijkt dat de bacteriële verontreiniging ten tijdevan verontreiniging laag, <100 kolonievormende eenheden (CFU) / product 2,16, maar de voedingsrijke milieu kamertemperatuur opslag maakt besmettende bacteriën prolifereren gevaarlijk hoge titers voorafgaand aan transfusie. Momenteel is de enige goedgekeurde methoden ter voorkoming bacterieel verontreinigde producten van het bereiken van een bloedplaatjes ontvanger door middel van kweek systemen en snelle point of care tests. Kort cultuur gebaseerde systemen bloedplaatjesproducten worden opgeslagen op een roerder bij 22 ° C gedurende 12-24 uur om de bacteriën te laten groeien in het product, waarop een 4-8 ml monster uit het product bloedplaatjes en geïnoculeerd in een fles bevattende voedingsmedia. De fles wordt geplaatst in een instrument dat de fles voor bacteriële groei controleert. Indien het instrument bacteriegroei in de fles detecteert wordt gemarkeerd en de bijbehorende bloedplaatjes eenheid wordt weggegooid. Terwijl dit proces is redelijk succesvol in het opsporen van fast growing organismen vele langzaam groeiende soorten groeien niet op een voldoende hoge titer te detecteren, waardoor de kans op vals-negatieve eenheden worden vrijgegeven voor transfusie 7,12,14,16,22. In tegenstelling tot de cultuur gebaseerde detectiesystemen, snelle point of care testen wordt meestal later in de bloedplaatjes opslagperiode uitgevoerd wanneer de bacteriële verontreiniging aanzienlijk is toegenomen. De hogere titers zijn verplicht sinds point of care tests zijn minder gevoelig dan de cultuur gebaseerde systemen, en alleen betrouwbaar detecteren bacteriën als ze eenmaal een titer ≥1 x 10 3 CFU / ml 17 bereiken. Maar dergelijke tests kunnen resultaten binnen 1 uur bemonstering verschaffen. Variabiliteit in de uitvoering van deze testen hebben geleid tot de introductie van een vals negatief product, waardoor een fatale septische reactie in de ontvanger 9.
Een alternatieve manier om het probleem van de bacteriële besmetting van bloedplaatjes producten te bestrijden is door het routinematig gebruik van een pathogeenreductie process dat vervuilende bacteriën kan inactiveren in plaats van te proberen om ze op te sporen. Met behulp van riboflavine als fotosensibilisator, in combinatie met UV-licht, is aangetoond dat de infectiviteit van een brede range van pathogene bloed overgedragen verontreinigingen te verminderen, waaronder bacteriën 3,4,8,10,19-21 .Het gebruik van riboflavine en UV licht voor pathogeenreductie is niet-toxisch en niet-mutageen en riboflavine en UV-licht behandelde componenten zijn getoond veilig voor transfusie ontvangers en voor degenen die omgaan bloedproducten 18 zijn. In het kort kan riboflavine molecules associëren met de nucleïnezuren (DNA en RNA) bacteriën, parasieten, virussen of kernhoudende cellen (bijvoorbeeld witte bloedcellen). Blootstelling aan UV-licht activeert riboflavine, waardoor een chemische verandering aan functionele groepen van de nucleïnezuren (voornamelijk guanine basen), waardoor het voorkomen van de replicatie en / of transcriptie van nucleïnezuren en het verlaten van het organisme geïnactiveerd 13. Kernloze cellen zoals plaattermijn en rode bloedcellen worden niet beïnvloed door de riboflavine chemie door het ontbreken van nucleïnezuur.
Eerdere werk met riboflavine en UV-licht technologie geëvalueerd een selecte groep van bacteriën met behulp van een experimenteel design bedoeld om een product bloedplaatjes verontreinigd met een klinisch relevante bacteriële belasting (<20 CFU / product) 8 na te bootsen. Het doel van deze studie was de riboflavine en UV-licht proces tegen hoge titer bacteriële verontreiniging te evalueren (> 1,0 x 10 5 CFU / ml) in trombocytenproducten behandeld plasma teneinde meet de totale bacteriële capaciteitsverlaging van het systeem. Gebaseerd op gegevens verzameld uit hemovigilantie studies 1, werd een panel van voorkomende gram-negatieve en gram-positieve organismen geselecteerd voor de evaluatie in dit onderzoek en onder meer de volgende soorten: Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Streptococcus mitis, Streptococcus pyogenes, Serratia marcescens, Yersinia enterocolitica ,Brucella neotomae, Bacillus cereus (vegetatieve vorm), Esherichia coli, Pseudomonas aeruginosa en Klebsiella pneumoniae. Alle organismen, behalve B. cereus, werden verkregen van ATCC en een prioriteit is op het verkrijgen van bacteriestammen die waren geïdentificeerd als zijnde geïsoleerd van bloedcomponenten geplaatst. De B. cereus onderzocht met dit onderzoek een klinische stam geïsoleerd uit een inwendig verontreinigde bloedplaatjes product.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bacteriële screening is gemeengoed geworden in het bloed bankinstellingen en voor vele locaties het dient als de primaire methode om transfusie van bacterieel besmette bloedplaatjes te voorkomen. Hoewel bacteriële screening dwangsom doorgaans het merendeel van de snel groeiende Gram-negatieve bacteriën zoals S. marcescens, E. coli en E. cloacae, dat worstelt om langzaam groeiende Gram-positieve bacteriën zoals S. detecteren aureus, Streptococcus spp. en S. epidermidis 8. Helaas zijn deze drie Gram-positieve bacteriën die betrokken zijn bij ruim 50% van alle besmette bloedplaatjes eenheden en de transfusie van bloedplaatjes producten die deze drie organismen heeft geleid tot de patiënt sterfte 1.
Bacteriële screening berust op het bacteriële titer in een trombocytenproduct voldoende hoog zijn zodat ten minste één organisme is opgenomen in de typische 4-8 ml monster screening. Als de bacteriële titer niet voldoende hoog is om een bacterie te worden meegenomen in de 4-8 ml monstervolume, wordt het apparaat foutief gemarkeerd als negatief en deze wordt vrijgegeven voor transfusie. Een alternatieve benadering voor bacteriële screening zou kunnen zijn om een proactief proces dat kan worden uitgevoerd op alle eenheden bloedplaatjes en dat de verontreinigende organismen als niet-functionele achterhaald is dienst.
In deze studie werden hoge titers bacteriën doelbewust toegevoegd aan bloedplaatjes eenheden aan de totale capaciteitsverlaging van riboflavine en UV-licht pathogenen reductieproces testen. Hoewel de bacteriële belasting getest in deze studie veel groter dan die normaal in bloedproducten ten tijde van schenking deze studie helpt te tonen dat de riboflavine en UV-licht proces kan de titer van levende bacteriën aanzienlijk verminderen verontreinigde bloedplaatjes eenheid door 2,6-5,4 log (99,7-99,9996% vermindering van verontreinigende bacteriën) (Figuur 2). Om een Accura verkrijgente log reductie waarde, is het essentieel dat de exploitant goede aseptische techniek samen met een precieze pipetteren vaardigheden bij het uitvoeren van de bacteriële titer stappen. Onnauwkeurige pipetteren bij het uitvoeren van seriële verdunningen kan leiden tot een opeenhoping van fouten, waardoor een onnauwkeurige meting titer.
De in deze studie verzamelde gegevens ondersteunt eerdere werk met riboflavine en UV-licht, waardoor het systeem uitgedaagd tegen lage niveau, klinisch relevante bacteriëmie (<20 CFU / eenheid). De vorige studie werd ontworpen om een echte klinische besmetting evenement na te bootsen en de resultaten toonden aan riboflavine en UV-licht effectief in het voorkomen van de groei van bacteriën op de 7-daagse bloedplaatjes opslagperiode was. Modellering op basis van de gegevens van de vorige studie suggereert dat de huidige risicoschattingen bacteriële besmetting van bloedplaatjes producten kunnen worden verminderd met wel 98% van het huidige niveau 8. De riboflavine en UV-licht proces steekt gunstig af bij bacteriële scherming, die alleen toonde een 66% efficiëntie voor bacteriële verontreinigingen te detecteren in eenheden bloedplaatjes bij provocatie met klinisch relevante bacteriële verontreiniging 8.
Zoals met alle technologieën, PRT behandeling van bloedplaatjes producten aan complicaties in verband met bacterieel besmette bloedplaatjes eenheden heeft zijn beperkingen te voorkomen. PRT-systemen zijn niet effectief tegen bacteriële sporen en niet inactiveren endotoxine, dus zelfs als er een PRT-systeem hoge titers van Gram-negatieve bacteriën kan inactiveren de resterende endotoxine kan nog steeds leiden tot een septische shock bij de ontvanger. PRT wordt het best uitgevoerd vroeg tijdens opslag voor de bacteriën kunnen doorgeven aan hoge titers.
Concluderend, zoals blijkt uit de combinatie van deze twee studies, de riboflavine en UV-licht proces is effectief in het verminderen van de bacteriële lading van zowel Gram-negatieve en Gram-positieve organismen en kan een alternatief voor bacteriële screening bieden. Routinematig treating bloedplaatjes producten met riboflavine en UV-licht heeft ook het extra voordeel van het verminderen van de mogelijke overdracht van andere bloed overdraagbare stoffen zoals virussen en parasieten.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Mirasol Illuminator | Terumo BCT | N/A | |
| Mirasol Treatment/Storage Bag | Terumo BCT | N/A | |
| Hematology Analyzer | Beckman-Coulter | Ac•T diff | |
| Blood Gas Analyzer | Siemens | RapidLab 1265 | |
| Sterile Docking Device | Terumo BCT | TSCD | |
| Platelet Incubator | Helmer | PC2200 | |
| Orbital Incubator Shaker | Lab-Line | 4628 | |
| Dry Incubator | Fisher | Iso-temp | |
| Class II A/B3 Biosafety Cabinet | Thermo-forma | 1286 | |
| Tubing Sealer | Sebra | Smart Sealer II | |
| Table Top Centrifuge | IEC | Centra GP8R | |
| 10 mL Syringe | BD | 309604 | |
| 30 mL Syringe | BD | 309650 | |
| 5 mL Dilution Tube | VWR | 211-0058 | |
| 50 mL Conical Tube | Corning | 430290 | |
| Micropipette | Gilson | P-200 | |
| Micropipette | Rainin | R-200 | |
| Repeat Pipette | Eppendorf | 4780 | |
| 1-200 µL Filter Tip | Costar | 4810 | |
| 25 mL Disposable Serrological Pipette | Costar | 4489 | |
| 5 mL Disposable Serrological Pipette | Costar | 4487 | |
| 35 mL 500 µM Riboflavin | Terumo BCT | 35 mL 500 µM | |
| Brucella Agar with 5% Horse Blood | BBL | 221547 | |
| Brain Heart Infusion | Teknova | B9993 | |
| Peptone Water | BD | 257087 | |
| Trypticase Soy Broth | BD | 299113 | |
| Trypticase Soy Agar | Remel | R01917 | |
| Heat Inactivated Horse Serum | Gibco | 26050 |
Riferimenti
- Brecher, M. E., Hay, S. N. Bacterial contamination of blood components. Clin. Microbiol. Rev. 18 (1), 195-204 (2005).
- Brecher, M. E., Holland, P. V., Pineda, A. A., Tegtmeier, G. E., Yomtovian, R. Growth of bacteria in inoculated platelets: implications for bacteria detection and the extension of platelet storage. Transfusion. 40 (11), 1308-1312 (2000).
- Cardo, L. J., et al. Pathogen inactivation of Leishmania donovani infantum in plasma and platelet concentrates using riboflavin and ultraviolet light. Vox Sang. 90 (2), 85-91 (2006).
- Cardo, L. J., Salata, J., Mendez, J., Reddy, H., Goodrich, R. Pathogen inactivation of Trypanosoma cruzi in plasma and platelet concentrates using riboflavin and ultraviolet light. Transfus. Apher. Sci. 37 (2), 131-137 (2007).
- Dodd, R. Y. Current viral risks of blood and blood products. Ann. Med. 32 (7), 469-474 (2000).
- Dodd, R. Y. Bacterial contamination and transfusion safety: experience in the United States. Transfus. Clin. Biol. 10 (1), 6-9 (2003).
- Dumont, L. J., et al. Screening of single-donor apheresis platelets for bacterial contamination: the PASSPORT study results. Transfusion. 50 (3), 589-599 (2010).
- Goodrich, R. P., Gilmour, D., Hovenga, N., Keil, S. D. A laboratory comparison of pathogen reduction technology treatment and culture of platelet products for addressing bacterial contamination concerns. Transfusion. 49 (6), 1205-1216 (2009).
- Greco-Stewart, V. S., et al. Serratia marcescens strains implicated in adverse transfusion reactions form biofilms in platelet concentrates and demonstrate reduced detection by automated culture. Vox Sang. 102 (3), 212-220 (2012).
- Keil, S. D., et al. Inactivation of Plasmodium spp. in plasma and platelet concentrates using riboflavin and ultraviolet light. Transfusion. 53 (10), 2278-2286 (2013).
- Kleinman, S., Chan, P., Robillard, P. Risks associated with transfusion of cellular blood components in Canada. Transfus. Med Rev. 17 (2), 120-162 (2003).
- Larsen, C. P., Ezligini, F., Hermansen, N. O., Kjeldsen-Kragh, J. Six years’ experience of using the BacT/ALERT system to screen all platelet concentrates, and additional testing of outdated platelet concentrates to estimate the frequency of false-negative results. Vox Sang. 88 (2), 93-97 (2005).
- Mundt, J. M., Rouse, L., Van den Bossche, J., Goodrich, R. P. Chemical and Biological Mechanisms of Pathogen Reduction Technologies. Photochem. Photobiol. , (2014).
- Murphy, W. G., et al. Screening platelet concentrates for bacterial contamination: low numbers of bacteria and slow growth in contaminated units mandate an alternative approach to product safety. Vox Sang. 95 (1), 13-19 (2008).
- Brien, S. F., et al. Current incidence and residual risk of HIV, HBV and HCV at Canadian Blood Services. Vox Sang. 103 (1), 83-86 (2012).
- Pearce, S., Rowe, G. P., Field, S. P. Screening of platelets for bacterial contamination at the Welsh Blood Service. Transfus. Med. 21 (1), 25-32 (2011).
- Ramirez-Arcos, S., Kou, Y., Perkins, H. Evaluation of a universal point-of-issue assay for bacterial detection in buffy coat platelet components. Vox Sang. 107 (2), 192-195 (2014).
- Reddy, H. L., et al. Toxicity testing of a novel riboflavin-based technology for pathogen reduction and white blood cell inactivation. Transfus. Med. Rev. 22 (2), 133-153 (2008).
- Ruane, P. H., et al. Photochemical inactivation of selected viruses and bacteria in platelet concentrates using riboflavin and light. Transfusion. 44 (6), 877-885 (2004).
- Tonnetti, L., Proctor, M. C., Reddy, H. L., Goodrich, R. P., Leiby, D. A. Evaluation of the Mirasol pathogen reduction technology system against Babesia microti in apheresis platelets and plasma. Transfusion. 50 (5), 1019-1027 (2010).
- Vanlandingham, D. L., et al. Photochemical inactivation of chikungunya virus in plasma and platelets using the Mirasol pathogen reduction technology system. Transfusion. 53 (2), 284-290 (2013).
- Walther-Wenke, G., et al. Monitoring bacterial contamination of blood components in Germany: effect of contamination reduction measures. Vox Sang. 100 (4), 359-366 (2011).
