During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.
Tijdens de postnatale ontwikkeling, onvolwassen granulecellen (prikkelende interneuronen) vertonen tangentiële migratie in de externe granulaire laag, en vervolgens radiale migratie in de moleculaire laag en de Purkinje cellaag aan de interne granulaire laag van de cerebellaire cortex bereiken. Default in trekkende processen induceert ofwel celdood of onjuiste plaatsing van de neuronen, wat leidt tot tekorten in diverse cerebellaire functies. Centripetal granule celmigratie omvat verschillende mechanismen, zoals chemotaxis en extracellulaire matrix degradatie, om de cellen te leiden naar hun uiteindelijke positie, maar de factoren die celmigratie in elke corticale lagen regelen slechts gedeeltelijk bekend. Bij onze werkwijze, zijn acute cerebellaire plakjes bereid uit P10 ratten worden granule cellen gemerkt met een fluorescent cytoplasmatisch merker en weefsels gekweekt op membraan inserts 4-10 uur voordat real-time monitoring van celmigratie door confocale macroscopie bij 37 ° C in deaanwezigheid van CO 2. Tijdens hun migratie in de verschillende corticale lagen van het cerebellum, kan granule cellen worden blootgesteld aan neuropeptide agonisten of antagonisten, proteaseremmers, remmers van intracellulaire effectoren of zelfs toxische stoffen zoals alcohol of methylkwik hun mogelijke rol in de regulering van de neuronale migratie te onderzoeken .
In ontwikkelingslanden cerebellum, zijn acht verschillende soorten neuronen geproduceerd opeenvolgend tussen de tweede week embryonale en postnatale tweede week bij knaagdieren 1. Afkomstig aanvankelijk uit, een primaire germinal zone, onrijpe korrel cellen (GC) zijn de laatste neuronen worden geproduceerd uit de externe granulaire laag (EGL), een tweede germinal zone 2. Gedurende de eerste drie weken postnataal, de cerebellaire cortex een gelaagde structuur in vier lagen waaronder EGL, de moleculaire laag (ML), de Purkinje cellaag (PCL) en de interne granulaire laag (IGL) (figuur 1). Door middelpuntzoekende migratie, onvolwassen GC, glutamaat interneuronen, bereikt de IGL binnen ongeveer 2 dagen. Door de derde postnatale week, de EGL verdwijnt en de IGL vormt wat de granulaire laag (GL) in de volwassen cerebellum genaamd. In de GL, GC ontvangt prikkelende synaptische input van bemoste vezels en unipolaire borstel cellen enremmende synaptische input van Golgi cel axonen. In de ML, GC axonen maken prikkelende synapsen met GABAergic neuronen waaronder Purkinjecellen, mand cellen, stellaatcellen, en Golgi cellen 2.
Real-time observatie van de cel beweging in acute cerebellaire plakjes verkregen uit vroege postnatale knaagdieren toont aan dat GC passen hun vorm gelijktijdig met veranderingen in de modaliteit en de snelheid van de migratie tijdens hun route in de cerebellaire cortex 3. Gedurende de eerste twee weken postnataal, GC precursors actief prolifereren bovenaan de EGL. In het middendeel van de EGL, postmitotische GC migreren tangentiaal in de richting van hun grotere proces. Aan de EGL-ML grens, GC vertragen hun beweging, de cellen beginnen om een korte verticale neergaande proces voeren in de ML. In de ML, GC hebben een verticaal langwerpig cel lichaam, een dunne slepende proces en een meer volumineuze toonaangevende proces, en migreren radiaal langs de Bergmann gliacellen vezels. In dePCL, GC stoppen hun beweging, maar na een langdurige stationaire fase (2 uur), zij het PCL-IGL grens over te steken. In het IGL, GC migreren naar de bodem van de laag in afwezigheid van gliale vezeldrager. Zodra de uiteinden van de leidende proces aanpak van de IGL-witte stof (WM) grens, GC langzaam en stoppen hun beweging. Dwarsdoorsneden van het cerebellum zijn de voorkeur voor tangentiële migratie studies in de EGL terwijl sagittale schijfjes zijn gewijd aan migratie radiaal in de ML, PCL en IGL. Sommige regulerende factoren van GC bewegingen waaronder neuropeptiden (bijv, somatostatine, PACAP) zijn tot nu toe geïdentificeerd, maar de complete mechanismen betrokken bij het spatiotemporele controle van GC migratie in elke corticale lagen zijn nog grotendeels onbekend 1,4,5,6.
GC migratie is onderzocht in de afgelopen 20 jaar door middel van video- en confocale microscopie met behulp van doorvallend licht verlichting voor geïsoleerde gekweekte cellen of fluorescentie detectie voor ACUte cerebellaire plakjes. Aanvankelijk lipofiele Dil en meer recent "Cell Tracker" kleurstoffen en cel tot expressie fluorescerende eiwitten werden gebruikt voor confocale of twee-foton microscopie 7,8. Succesvolle experimenten afhankelijk van een aantal specifieke procedures die het protocol eenvoudig maar niet gemakkelijk. In het bijzonder acute plakjes tijdens observaties worden gestabiliseerd het algemeen met een zelfgemaakte nylon mesh-netwerk 9. De intensiteit van licht verlichting moet zo laag mogelijk fototoxiciteit en fotobleken vermijden door multipunt scanning confocale microscoop benadering voorgesteld zijn. Bovendien, de temperatuur en CO 2 zijn de belangrijkste milieu-parameters, omdat instabiliteit kan neuronale migratie beïnvloeden. Te vergemakkelijken en te verfijnen van de experimentele procedures, hebben we een confocale macroscopie protocol dat slice bewegingen beperkt, zorgt voor een constante milieu-parameters, vermindert photobleaching, verhoogt gezichtsveld (in de orde van millimeter) en consequ ontwikkeldently het aantal cellen (tientallen), die kunnen worden gevolgd door middel van beeldanalyse. Aldus, 180 urn dikke plakken worden gekweekt op membraan inserts en 6-well platen direct overgebracht onder een 2X gemotoriseerde doelstelling van commerciële confocale macroscoop voorzien van een grote incubatiekamer, temperatuur en CO 2 controllers en trillingsregelstelsel. Time-vervalt en z-stacks worden dan uitgevoerd over verscheidene uren, farmacologische gereedschappen of biologisch actieve moleculen kunnen worden toegevoegd of afgegeven in het incubatiemedium. Deze werkwijze kan ook worden aangepast om de migratie van andere soorten neuronen in het cerebellum en cerebrum in verschillende ontwikkelingsstadia te bestuderen.
Dit protocol beschrijft de cultuur van acute P10 rat cerebellaire schijfjes in het Transwell systeem en de fluorescerende etikettering van GC met een groen fluorescerende kleurstof om celmigratie te bestuderen tijdens de postnatale ontwikkeling door middel van confocale macroscopie. Dit protocol maakt observaties van celmigratie gedurende een periode tot 12 uur en het testen van de mogelijke rol van regulerende factoren in migratie, agonisten of antagonisten van neuropeptiden, enzymremmers, signaaltransductie modulatoren of toxische stoffen tijdens het experiment. Een kleine opening in het membraan insert met een pipetpunt moet toediening van verbindingen in het incubatiemedium te vergemakkelijken. Een zelfgemaakte gekromde tip pipet kan worden gebruikt om de afgifte van de oplossing te vergemakkelijken.
Een onderwerp van celmigratie studies op levend weefsel slices is dat de bewegingen van het weefsel zelf kan cell tracking moeilijk. Overwegende dat de vorige benaderingen voorgesteld om voorzichtig te stabiliseren slices met een nylon gaas of een dunne laag van rattenstaart collageen 7,17, een groot voordeel van deze techniek is de eenvoudige en directe overdracht van een 6-well kweekplaat met cerebellaire plakjes op het membraan inserts van de CO 2 incubator onder doelstelling van een confocale macroscoop. Geïntegreerde temperatuur en CO 2 controllers bieden ook passende en voortdurende milieu-parameters essentieel zijn voor celmigratie 9. Daarom worden kweekcondities gehouden tijdens observaties en weefsels bewegingen worden geminimaliseerd aangezien segmenten goed bevestigd aan het membraan insert. Stabilisatie van het weefsel wordt gecontroleerd door het volgen van de positie van slice randen of Purkinje cellen die moeten worden vastgesteld verwijzingen tijdens de acquisitie. Bovendien kan cerebellaire segmenten (tussen 12 en 18) verdeeld in 6 wells van de plaat snel waargenomen in detail met een gemotoriseerde fase en een optische zoom. Door de grote werkafstand (X2, 39 mm) van de droge doelstelling, epi-observation vrij is van immersie en het beheer van verbindingen in het kweekmedium is veel gemakkelijker. Daarom macroscopie milieu parameters en cultuur support overeenkomsten in CO 2 incubator en confocale leiden tot maximale behoud van het biologische monster.
Een ander voordeel van het protocol is het groot gezichtsveld en daardoor het grote aantal cellen die gelijktijdig kunnen worden waargenomen. Zo hebben we eerder vastgesteld dat de dichtheid van fluorescerende GC met radiale migratie in de ML was 1124 ± 138 cellen / mm 2 18. Confocale macroscopie (X2, NA = 0,234) een onderste laterale resolutie in vergelijking met confocale microscopie (40X, NA = 1,25), maar cellichamen van GC's kunnen gemakkelijk worden gevolgd en de gemiddelde snelheid van migratie vergelijkbaar tussen de twee technologische benaderingen 7,18 .
Naast de technische verbetering voor het aankopen, de kwaliteit van het weefsel plakjes en the kwaliteit van de etikettering zijn belangrijke punten voor een succesvolle experimenten. Altijd media en weefsels op het ijs tijdens de dissectie processen, te elimineren olie op vibratome bladen en niet plakjes weefsel te gebruiken in contact met lijm. Sagittale en transversale secties zijn ingericht om respectievelijk radiale en tangentiële migratie. Gebruik verschillende lengtes incubatie passende detectie in de verschillende corticale lagen van het cerebellum. Lange incubatietijden (tot 8 uur) nodig om de migratie van talrijke GC detecteren in de PCL en IGL. Omdat GC migratie is een fysiologisch proces tijdens specifieke tijdruimtelijke ramen, de positieve controle is dat de cellen hebben om goed te migreren. Vooral talrijke spindel GC in het ML is een van de belangrijkste gezondheidsproblemen indicator sagittale cerebellaire plakjes. Voor het starten van experimenten, is observatie van GC bewegingen in de ML voorgesteld. Inderdaad moet de vorm van GC met verticale richting cellichaam worden beschouwd als een referentiepunt ac beginneninquisitie opeenvolgende control (2 uur) en behandeling (2 uur) perioden die gemakkelijk kunnen worden uitgevoerd in de ML.
Fluorescerende kleurstoffen zoals Cell Tracker familie of fluorescerende eiwitten tot expressie gebracht door genetische constructen kunnen worden gebruikt als tracers celmigratie studies. Vanwege de langzame kinetiek van GC migratie (1 stack elke 30 min), kan veelkleurig experimenten worden uitgevoerd in sequentiële modus sinds 4 lasers balken (405, 488, 532 en 633 nm) wordt op het systeem. Gezien middelpuntzoekende en centrifugaal radiale migratie, het bijhouden van andere interneuronen kunnen ook worden gerealiseerd 18. In het bijzonder kunnen minder talrijke celtypen gemakkelijker worden gelokaliseerd met een groot beeldveld. Tenslotte kan dit protocol worden gebruikt om celmigratie studeren in andere stadia van ontwikkeling van het cerebellum, maar ook andere hersengebieden.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door het Instituut voor Onderzoek en Innovatie in de biogeneeskunde (IRIB), de Cell Imaging Platform van Normandië (PRIMACEN), Inserm, IBiSA, de Universiteit van Rouen, het Europees Fonds voor Regionale Ontwikkeling (EFRO – Perene, Interreg 4A), de LARC-Neurowetenschappen Network en de regio Haute-Normandie.
Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) nutrient mixture F-12 | Sigma-Aldrich | D8437 | |
Hank's balanced salt solution 10X | Sigma-Aldrich | H1641 | |
PACAP38 | INRS, Canada | Bourgault et al., 200919 | |
PAI-1 | Calbiochem | 528208 | |
N-2 supplement | Fisher Scientific / Gibco/ invitrogen | O973 | |
cyanoacrylate glue | Loctite | ||
Cell Tracker Green CMFDA | Invitrogen | C2925 | |
Polyester Transwell-Clear inserts | Corning | 3452 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
6-well cell culture cluster | Corning | 3516 | |
DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
Tissue culture dish 35 mm diameter | BD Falcon | 353004 | |
Tissue culture dish 100 mm diameter | Thermo SCIENTIFIC | 130182 | |
Polypropylen tube (15 ml) | BD Falcon | 352096 | |
Ethanol 70% | Fisher Chemical | E/0800DF/21 | |
biological safety cabinet fume hood | Thermo Scientific | MSC9 Class II A2 | |
adjustable-volume pipette (0,5-10 µL) | Eppendorf | 4910 000.018 | |
gyro-rocker, SSL3 | Stuart | ||
CO2 incubator, Hera Cell 150 | Thermo Scientific | ||
vibrating blade microtome, VT1000S | Leica Microsystems | ||
confocal macroscope, TCS LSI | Leica Microsystems | ||
temperature controller | PeCon | ||
CO2-controller | PeCon | ||
Stereomicroscope, M205 C | Leica Microsystems | ||
Operating scissors, curved, blunt/blunt | Medicon | 03.03.17 | |
Hardened fine iris scissors, straight, sharp/sharp | FST | 149090-11 | |
Dumont #3 and #5 forceps | FST | 11293-00 and 11252-20 | |
Vibratome injector blades/single edge | Leica Microsystems | 39053250 | |
standard scalpel handle #3 solid | FST | 10003-12 | |
surgical blade #15 | Swann-Morton | 205 |