JoVE Journal > Immunology and Infection
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Immunologia e infezioni

Análisis De Las Funciones De Los MastOcitos In Vivo Usando ' MastCell Knock-in' Ratones

Published: May 27, 2015
doi:
10.3791/52753
, , , , ,
1Department of Pathology,Stanford University School of Medicine, 2Department of Microbiology & Immunology,Stanford University School of Medicine

Summary

Describimos un método para la generación de células de mástil derivadas in vitro, su engraftment en ratones célula-deficientes del mástil, y el análisis del fenotipo, de los números y de la distribución de las células de mástil engrafted en diversos sitios anatómicos. Este protocolo se puede utilizar para evaluar las funciones de los mastocitos in vivo.

Abstract

Los mastocitos (MCs) son células hematopoyéticas que residen en diversos tejidos, y son especialmente abundantes en sitios expuestos al medio externo, como la piel, las vías respiratorias y el tracto gastrointestinal. Mejor conocidos por su papel perjudicial en las reacciones alérgicas dependientes de IgE, los MCs también han surgido como actores importantes en la defensa del huésped contra el veneno y las bacterias y parásitos invasores. El fenotipo y la función del mc pueden ser influenciados por los factores microambientales que pueden diferir según la localización anatómica y/o basado en el tipo o la etapa del desarrollo de inmunorespuestas. Por esta razón, nosotros y otros hemos favorecido los acercamientos in vivo sobre métodos ines vitro para ganar la penetración en funciones de la bujía métrica. Aquí, se describen los métodos para la generación de ratón derivado de la médula ósea cultivada MCs (BMCMCs), su transferencia adoptiva en ratones genéticamente deficientes en MC, y el análisis de los números y la distribución de MCs transferidos adoptivamente en diferentes sitios anatómicos. Este método, denominado el enfoque‘mast cell knock-in’, se ha utilizado ampliamente en los últimos 30 años para evaluar las funciones de los MC y los productos derivados de MC in vivo. Discutimos las ventajas y las limitaciones de este método, a la luz de los acercamientos alternativos que se han desarrollado en los últimos años.

Introduction

Los mastocitos (MCs) son células hematopoyéticas que surgen de progenitores pluripotentes de la médula ósea1-3. Después de la egressión de la médula ósea, los progenitores de las MCs migran a varios tejidos donde se convierten en MCs maduros bajo la influencia de factores de crecimiento locales1-3. Los MCs residentes en tejidos están estratégicamente ubicados en interfaces huésped-ambiente, como la piel, las vías respiratorias y el tracto gastrointestinal, donde se comportan como una primera línea de defensa contra los insultos externos3-6. Los MCs se subclasifiquen a menudo basados en sus características fenotípicas de la “línea de fondo” y sus localizaciones anatómicas. En ratones, se han descrito dos tipos de MCs: “tipo tejido conectivo” MCs (CTMCs) y MCs de la mucosa (MMCs)1-3,7,8. Los CTMCs a menudo se encuentran alrededor de las vénulas y cerca de las fibras nerviosas, y residen en cavidades serosales, mientras que los MMCs ocupan ubicaciones intraepiteliales en el intestino y la mucosa respiratoria1-3.

Se han aplicado numerosas metodologías para estudiar las funciones biológicas de las MCs9-13. Muchos grupos se han centrado en enfoques in vitro utilizando líneas celulares (como las líneas de MC humanas HMC114 o LAD215,16),MCs derivados in vitro (como MCs derivados de sangre periférica humana17,o MCs cultivados derivados de médula ósea de ratón [BMCMCs]18,MCs cultivados derivados de la piel fetal [FSCMCs]19 y MCs derivados de células peritoneales [PCMCs]20)o MCs aislados ex vivo de diferentes sitios anatómicos. Todos estos modelos son ampliamente utilizados para estudiar los detalles moleculares de la biología mc, tales como vías de señalización implicadas en la activación mc. Sin embargo, un aspecto importante de la biología de los MCs es que sus características fenotípicas y funcionales (porejemplo,el contenido de proteasa de gránulos citoplasmáticos o la respuesta a diferentes estímulos) pueden ser moduladas por la ubicación anatómica y el microambiente2,7. Dado que la mezcla exacta de tales factores que se encuentran in vivo puede ser difícil de reproducir in vitro,favorecemos el uso de enfoques in vivo para obtener información sobre las funciones de los MCs9.

Existen varias cepas de ratón con deficiencia genética de MC, como los ampliamente utilizados WBB6F1–Kit W/W-v o C57BL/6-Kit W-sh/W-sh ratones. Estos ratones carecen de expresión y/o actividad de KIT (CD117), el receptor del principal factor de crecimiento MC factor de células madre (SCF)21,22. Como resultado, estos ratones tienen una profunda deficiencia de MC, pero también tienen anomalías fenotípicas adicionales relacionadas con sus mutacionesc-kit (en los ratones WBB6F1–Kit W/W-v) o con los efectos de la gran inversión cromosómica que resulta en una reducción de la expresión de c-kit (en los ratones C57BL/6-Kit W-sh/W-sh) 9,10,12,23. Más recientemente, se han reportado varias cepas de ratones con deficiencia de MC constitutiva independiente dec-kit24-26. Todos estos ratones y algunos nuevos tipos adicionales de ratones inducibles deficientes en MC han sido revisados recientemente en detalle9,10,13.

Aquí, se describen los métodos para la generación de ratón derivado de la médula ósea MCs cultivados (BMCMCs), su transferencia adoptiva en ratones deficientes en MC, y el análisis de los números y la distribución de MCs transferidos adoptivamente en diferentes sitios anatómicos. Este método llamado “knock-in de mastocitos” se puede utilizar para evaluar las funciones de los MC y los productos derivados de MC in vivo. Discutimos las ventajas y las limitaciones de este método, a la luz de los acercamientos alternativos que se han desarrollado en los últimos años.

Protocol

Todo el cuidado y la experimentación animal se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud y con la aprobación específica del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Stanford. 1. Generación y Caracterización De Mastocitos Cultivados Derivados De La Médula Ósea (BMCMCs). Nota: Los BMCMCs dispensadores de aceite se deben generar de las células de la médula del mismo fondo genético que los…

Representative Results

En la Figura 1se muestra una visión general del enfoque de’knock-in de mastocitos’e incluye la generación de BMCMCs, el número de células que deben injertrse i.p., i.d. o i.v. en ratones deficientes en MC (el número puede variar si se indica en función del diseño experimental) y el intervalo entre el injerto y el experimento dependiendo del sitio de inyección (este intervalo también puede variar, si se indica; por ejemplo,el contenido de mediadores almacenados en los gránulos …

Discussion

Casi 30 años después de su descripción inicial38, el enfoque‘mast cell knock-in’sigue proporcionando información valiosa sobre lo que los MCs pueden o no pueden hacer in vivo. Las funciones de MCs eran de largo probablemente limitadas a su papel en alergia. Los datos generados utilizando el enfoque‘mast cell knock-in’han cambiado esta visión, al proporcionar evidencia de que los MCs pueden, entre otras funciones, desempeñar papeles críticos en la defensa del huésped contra ci…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

N.G. ha recibido becas de la “Fondation pour la Recherche Médicale FRM” francesa y de la Fundación Philipp; R.S. cuenta con el apoyo de la Fundación Lucile Packard para la Salud infantil y el premio CTSA de los NIH/NCRR de Stanford número UL1 RR025744; P.S. cuenta con el apoyo de una beca Max Kade de la Fundación Max Kade y la Academia Austríaca de Ciencias y una beca Schroedinger del Fondo Austriaco para la Ciencia (FWF): J3399-B21; S.J.G. reconoce el apoyo de las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud U19 AI104209, NS 080062 y del Programa de Investigación de Enfermedades Relacionadas con el Tabaco de la Universidad de California; L.L.R. reconoce el apoyo de la Arthritis National Research Foundation (ANRF) y la subvención K99AI110645 de los Institutos Nacionales de Salud.

Materials

1% Antibiotic-Antimycotic Solution Corning cellgro 30-004-Cl
3 ml Syringe Falcon 309656
35 mm x 10 mm Dish Corning cellgro 430588
5 ml Polystyrene Round Bottom Tube Falcon 352058
Acetic Acid Glacial Fisher Scientific A35-500
Alcian Blue 8GX Rowley Biochemical Danver 33864-99-2
Allegra 6R Centrifuge Beckman
Anti-mouse CD16/32 (clone 93) Purified eBioscience 14-0161-81
2-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M7522
BD 1 ml TB Syringe BD Syringe 309659
BD 22G x1 (0.7 mm x 25 mm) Needles BD Precision Glide Needle 205155
BD 25G 5/8 Needles BD Syringe 305122
BD 30G x1/2 Needles BD Precision Glide 305106
Blue MAX Jr, 15 ml Polypropylene Conical Tube Falcon 352097
Chloroform Fisher Scientific C298-500
Cytoseal 60 Mounting Medium Richard-Allan Scientific 8310-4
Cytospin3 Shandon NA
DakoCytomation pen Dako S2002
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1x Corning cellgro 15-013-CM
Ethanol Sigma Aldrich E 7023-500ml
Fetal Bovine Serum Heat Inactivated Sigma Aldrich F4135-500ml
FITC Conjugated IgG2b K Rat Isotype Control eBioscience 14-4031-82
Fluorescein Isotiocyanate (FITC) Conjugated Anti-mouse KIT (CD117; clone 2B8) eBioscience 11-1171-82
Formaldehyde Fisher Scientific F79-500
Giemsa Stain Modified Sigma Aldrich GS-1L
Isothesia Henry Schein Animal Health 29405
May-Grunwald Stain Sigma Aldrich MG-1L
Multiwell 6 well plates Falcon 35 3046
Olympus BX60 Microscope Olympus NA
Paraplast Plus Tissue Embedding Medium Fisher Brand 23-021-400
PE Conjugated IgG Armenian Hamster Isotype Control eBioscience 12-4888-81
Phosphate-Buffered-Saline (PBS) 1x Corning cellgro 21-040-CV
Phycoerythrin (PE) Conjugated Anti-mouse FceRIa (clone MAR-1) eBioscience 12-5898-82
Propidium Iodide Staining Solution eBioscience 00-6990-50
Recombinant Mouse IL-3 Peprotech 213-13
Safranin-o Certified Sigma Aldrich S8884
Tissue culture flasks T25 25 cm2 Beckton Dickinson 353109
Tissue culture flasks T75 75 cm2 Beckton Dickinson 353110
Toluidine Blue 1 % Aqueous LabChem-Inc LC26165-2
Recombinant Mouse SCF Peprotech 250-03
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Riferimenti

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Gaudenzio, N., Sibilano, R., Starkl, P., Tsai, M., Galli, S. J., Reber, L. L. Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using ‘Mast Cell Knock-in‘ Mice. J. Vis. Exp. (99), e52753, doi:10.3791/52753 (2015).
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