JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscienze

Microchambers Agarose per lungo termine Imaging di calcio<em> Caenorhabditis elegans</em

Published: June 24, 2015
doi:
10.3791/52742
, ,
1Max Planck Institute for Biophysical Chemistry

Summary

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Abstract

Comportamento è controllato dal sistema nervoso. Calcio Imaging è un metodo semplice nel nematode Caenorhabditis elegans trasparente per misurare l'attività di neuroni durante vari comportamenti. Per correlare attività neurale con il comportamento, l'animale non deve essere immobilizzata, ma dovrebbe essere in grado di muoversi. Molti cambiamenti comportamentali si verificano durante scale temporali lunghe e richiedono la registrazione di più di molte ore di comportamento. Questo rende anche necessario cultura i vermi in presenza di cibo. Come possono i vermi essere colta e la loro attività neurale ripreso su scale temporali lunghe? Agarose Microchamber Imaging (AMI) è stato precedentemente sviluppato per la cultura e osservare piccole larve e ora è stato adattato per studiare tutte le fasi della vita dai primi di L1 fino alla fase adulta della C. elegans. AMI può essere eseguita su diverse fasi di vita di C. elegans. Calcio Imaging a lungo termine viene ottenuta senza immobilizzare gli animali utilizzando le esposizioni a breve innescate esternamente comcombinati con un elettrone moltiplicando registrazione dispositivo (EMCCD) fotocamera ad accoppiamento di carica. Zoom out o la scansione in grado di scalare fino questo metodo per immagine fino a 40 vermi in parallelo. Così, viene descritto un metodo per il comportamento di immagine e l'attività neurale su scale temporali lunghe in tutti gli stadi di vita di C. elegans.

Introduction

Caenorhabditis elegans has been established as a model system to study behavior1. Due to its amenability to genetics, the molecular and cellular mechanisms underlying behavior can be studied. Many behaviors occur on long time scales. Two principal approaches can be used to observe motile animals over long time scales. The first approach is following the animal during movement using an automated stage or camera2-8 and the second is to restrict the movement to a range that is at least as small as the field of view of the camera9-14. Both methods have their advantages. Tracking allows following an animal over long spatial ranges but limits the number of animals that can be discerned in one experiment. Restricting the movement of the animals allows scaling up the observation to many individuals at the same time by using arrays of restricted compartments.

Because the nematode is transparent, live fluorescent imaging can be performed non-invasively15. Calcium imaging provides a functional readout for the activity of excitable cells and is established for C. elegans16-20. Calcium enters the cell via channels in the plasma membrane that open upon depolarization. Thus, calcium acts as a proxy for neural activity. Calcium sensors can be grouped in two major classes, ratiometric and non-ratiometric sensors. Both classes employ conformational changes of calcium-binding proteins induced upon binding of calcium. Ratiometric sensors contain two fluorescent proteins. When the lower-wavelength fluorescent protein is excited, a part of the light energy is transmitted to the higher wavelength fluorescent protein as a function of their distance in a process called Fluorescence Resonance Energy Transfer or Förster Resonance Energy Transfer (FRET)21. Non-ratiometric sensors are based on circularly permuted GFP and employ de-quenching of the fluorophore caused by calcium binding22. Each class has its advantages. While ratiometric sensors are less sensitive to movement or expression artifacts, non-ratiometric sensors typically have a higher dynamic range. Both ratiometric and non-ratiometric sensors have been useful to study the activity of excitable cells in C. elegans16-20,23,24.

When doing long-term fluorescence imaging, the experimenter will have to deal with several potential challenges: 1. Disturbance of behavior through excitation light: Worms are sensitive to short-wavelength fluorescence excitation light and avoid light from the violet to blue range that is used for calcium imaging25,26. Worms respond with either a backward or a forward escape response25,26. Thus, the amount of light needs to be controlled. 2. Bleaching of the fluorescent sensor protein: Often, bleaching of the fluorescent protein hampers long-term imaging. Typically, however, light intensities that are needed to observe bleaching are higher than the light intensities that cause disturbing effects on the behavior of the animals. Thus, bleaching is only a theoretical problem in this type of calcium imaging. 3. Worms inside the microchambers are not fixed and move constantly during wake behavior and images may appear blurred if the worm is not immobilized. All these challenges can be solved using extremely short exposure times with low light intensity. This can be realized by using a highly sensitive EMCCD camera with short exposure times and external triggering of a light emitting diode (LED). To expose the worms to the illumination light as briefly as possible (only during the exposure time of the camera) the LED is externally triggered using a transistor-transistor logic (TTL) signal that the camera emits during exposure resulting in an illumination of the worm for precisely the time the camera chip is exposed. This also means that the EMCCD chip will be dark during data readout, which is optimal for readout performance of this chip.

Previously, agarose microchambers have been developed for long-term fluorescence imaging of C. elegans larvae9. Here, it is described how agarose micro-chambers can be used for long-term calcium imaging for any life stage of C. elegans, how calcium imaging can be performed, and how this method can be upscaled to assay many individual worms in parallel.

Protocol

1. Gli strumenti, di coltura, e piatti Utilizzare un microscopio che è in grado di mantenere il campione selezionato e che è dotato di una fase automatica. Costruire un calorifero coperchio su misura o acquistare una soluzione commerciale. Impostare un sistema di telecamere a LED-EMCCD in cui l'esposizione della fotocamera trigger illuminazione LED attraverso un segnale TTL con le istruzioni del produttore. Nota: vedere Consigli per i dettagli. Polydimethylsiloxan (PDMS) francobolli: Realizzare PDMS francobolli in un impianto di microfluidica o che abbiano le PDMS francobolli prodotte da una fonderia commerciale. Per usare una fonderia commerciale, inviare un file autocad alla società e specificare la profondità (15 micron, ad esempio) del dispositivo. Dopo la consegna dalla fonderia, tagliate il chip PDMS nei suoi 16 francobolli con un bisturi. Incollare ogni singolo francobollo di un vetrino con plasma ad aria. Per l'incollaggio, esporre sia il timbro PDMS e il vetrino di plasma ad aria per unaattacco 1 min (utilizzando le impostazioni più alte di plasma a 0,5 mbar). Assicurarsi che le superfici di incollaggio rivolti verso l'alto durante il trattamento al plasma. Quindi, mettere il timbro PDMS sul vetrino. Dai piatto fondo di 3,5 cm e tagliare una superficie quadrata di 18 x 18 mm dal centro del fondo del piatto con una fresatrice verticale e taglierine taglienti. Utilizzare bassa velocità di rotazione della fresa e l'alimentazione lenta per impedire la plastica da fusione a causa di calore prodotto per attrito. Preparare diversi piatti contemporaneamente. Nota: Il piatto inferiore può essere riutilizzato più volte dopo l'esperimento, se è pulito dopo immersione in puro etanolo O / N. Agarosio: Sciogliere 3 g alta punto di fusione agarosio in 100 ml S-basali (5,85 g NaCl, 1 g K 2 HPO 4, 6 g KH 2 PO 4, 1 ml di colesterolo (5 mg / ml in etanolo), H 2 O a 1 L, sterilizzare in autoclave), facendo bollire. Preparare delle aliquote del disciolto agarosio in 2 ml provette Eppendorf e store. Inoltre, preparare un lotto di basso punto di fusione agarosio esattamente allo stesso modo del punto agarosio alta fusione. Prima dell'uso, posizionare 3 aliquote di alto punto di fusione agarosio su un blocco di riscaldamento a 95-98 ° C. Prima dell'uso, posizionare un'aliquota di basso punto di fusione agarosio su un blocco di riscaldamento a 95-98 ° C fino a quando non è fuso e poi su una piastra riscaldante a 30 – 35 ° C. 2. Selezione degli animali Crescere i vermi a bassa densità su piastre NGM teste di serie per ottenere animali puri. Assicurarsi che non vi è abbondanza di cibo e solo pochi animali sul piatto. Per l'imaging L1 larve, trasferire circa 30 uova contenenti embrioni allo stadio di pretzel su un piatto fresco seminato NGM. Per il trasferimento di fasi successive larvali o adulti C. elegans, il trasferimento di circa 30 vermi su un piatto fresco seminato NGM. 3. Preparazione di agarosio microchambers Preparazione del piatto: Prendere un piatto di plastica con una apertura quadrata di 18 x 18 mm in basso e posizionarlo a rovescio con l'apertura rivolta verso l'alto. Chiudere l'apertura mettendo un pezzo di nastro biadesivo appiccicoso di 20 x 20 mm sull'apertura. Ruotare il piatto intorno in modo che il nastro adesivo è sul fondo e posizionare il piatto su una superficie dura. Tagliare l'apertura libera con un bisturi. Usando una pipetta P1000, occupare 2 ml di 3% di alta punto di fusione agarosio in S-basale nel piatto. Inserire l'agarosio sulla zona che circonda l'apertura e lasciare solidificare. Attendere che l'agarosio è solido. Girare intorno al piatto e staccare la pellicola protettiva che ricopre il nastro adesivo su due lati in modo che la parte adesiva rimane sul piatto e verrà esposta. Nota: Come risultato, un sottile anello di nastro adesivo circonderà all'esterno dell'apertura. L'agarosio funge da serbatoio di umidità che poi circondare il campione. Casting di microchambers: Esporre the superficie PDMS per lo stampaggio con plasma ad aria per 20 – 60 sec. Nota: Questo trattamento al plasma rende PDMS superficie idrofila, che impedisce l'intrappolamento di bolle d'aria e produce stampe nitide. Costruire due distanziatori di uguale altezza impilando 5-9 vetrini. Place, parallelamente ai loro lati lunghi, il primo gruppo distanziali, poi un singolo vetrino, poi ancora una pila distanziale. Posizionare il vetrino che contiene il timbro PDMS ortogonalmente attraverso i distanziali. Regolare l'altezza dei distanziatori in modo che vi sia uno spazio di circa 1,5 mm tra la superficie di formatura dello stampo PDMS e il singolo vetrino. Mettere una goccia di liquido caldo ad alto punto di fusione agarosio sul vetrino singolo vicino al timbro PDMS e rapidamente scivolare il PDMS bollo verticalmente nel agarosio liquido. Lasciate che il agarosio solidificare. Verificare che diventa un aspetto opaco, che di solito dura circa 2 minuti. Estrarre il timbro in verticale con un movimento. Nota: E 'conveniente per glue il distanziatore scorre insieme con nastro biadesivo appiccicoso. Il movimento verticale del timbro impedisce bolle d'aria dal rimanere intrappolati in agarosio. Trasferire le uova o vermi insieme con i batteri OP50 sul agarosio utilizzando una raffinata scelta filo di platino. Distribuire un uovo o una vite senza fine per ogni camera insieme con il cibo usando un ciglio. Riempire circa 30 uova su un pad agarosio. Tagliare lastra agarosio contenente i microchambers riempite in un quadrato di circa 15 x 15 mm in modo che si adatta bene nell'apertura del piatto. Sollevare la lastra di agarosio piazza con una pinza e posizionarlo a testa in giù su un vetrino di vetro di 20 x 20 mm. Una volta sceso, non sollevare di nuovo o scorrere in giro perché ciò può causare i batteri e vermi per essere spinto fuori dalle loro stanze. Montaggio del piatto: Posizionare il coprioggetto di vetro sulla apertura del piatto di plastica. Premere delicatamente verso il basso il vetrino di vetro sul ring in doppia faccia nastro adesivo.Fare attenzione a non rompere il vetro. Girare il piatto a testa in giù e usare una pipetta P1000 per colmare il divario tra la soletta agar contenente le microchambers e il serbatoio agarosio con liquido a basso punto di fusione agarosio raffreddata a circa 30 ° C. Attendere che l'agarosio si è solidificato. Sigillare il piatto con un coperchio. Per microscopi invertiti utilizzare un coperchio riscaldato. Per microscopi diritti utilizzare un coperchio normale e sigillare il piatto con Parafilm. Dopo aver terminato la preparazione di microchambers, controllarli sotto uno stereomicroscopio. Il ripieno corretta è fondamentale. Vedi la discussione per i dettagli. 4. Imaging di calcio Utilizzare ceppi transgenici che esprimono sensori di calcio geneticamente codificati quali HBR16 (goeIs5 [PNMR-1 :: SL1-GCaMP3.35-SL2 :: unc-54-3'UTR, unc-119 (+)]) 27. Utilizzare un microscopio composto attrezzato per tutto il campo epifluorescenza. Collegare l'uscita TTL della fotocamera EMCCD al'ingresso TTL del LED, in modo che ogni volta che la fotocamera registra un fotogramma campione sarà illuminato. Utilizzare un tempo di esposizione di circa 5 msec. Utilizzare guadagno EM nel range di 50-300. Specificare una corsa film di scoppio per 24 ore con ogni verme essere ripreso ogni 15-30 minuti prima per 20 secondi con DIC, poi per 20 secondi con una fluorescenza GFP per registrare GCaMP, e poi prendere una immagine finale del segnale mKate2 è preso a di controllo per i livelli di espressione. Utilizzare un frame rate di 2 / sec durante ogni raffica. Per il controllo dei dati visivi, usare una mappa falsi colori per migliorare la visibilità delle piccole variazioni di intensità di fluorescenza. Dati fluorescenti trama come Af / F, con F è il valore medio basale di fluorescenza. Una descrizione dettagliata di analisi dei dati calcio può essere trovato in letteratura 20. 5. parallelo AMI di multiple Worms Porre la capsula contenente i microchambers sul microscopio, concentrarsi sul campione e coinvolgere il autofocus. Impostare un protocollo software in modo che la fotocamera acquisisce una raffica di 40 fotogrammi di immagini in 20 secondi ogni mezz'ora per 24 ore, che si tradurrà in 1.920 fotogrammi al verme, una ragionevole quantità di dati. Impostare la scansione in modo che visita ogni verme con il palcoscenico. Lo scopo di filmare circa 30 vermi in una corsa. Immagine più vermi per lo zoom out, vale a dire, con un ingrandimento minore. Utilizzare un ingrandimento inferiore per coprire più microchambers con il chip telecamera e filmare contemporaneamente più microchambers adiacenti. Dopo la fine della acquisizione dell'immagine, separare i dati per ogni singola camera ritagliando una regione di interesse che copre un animale. Per valutare rapidamente i dati di mobilità, utilizzare telaio sottrazione 28-32. 6. Imaging diverse fasi della vita di C. elegans Utilizzare microchambers agarosio per tutte le fasi della vita di C. elegans da L1 a compresi dauers adulti e. Utilizzare i opportune dimensioni della camera per difle fasi della vita di- che sono indicati nella tabella 1. Fase di vita Formato da Camera Profondità fornello Tempo di registrazione tipico Ingrandimento L1 190 x 190 micron 10 – 15 micron uovo – mid L2 400X L2 370 x 370 micron 15 micron uovo – L3 200X Dauer larva 370 x 370 micron 25 micron 4 giorni 200X L3 700 x 700 micron 45 micron L2 – L4 200X L4 700 x 700 micron 45 micron giovane L4 – giovane adulto 100X Giovani adulti 700 x 700 micron 45 micron </td> 12 – 24 ore 100X Tabella 1. formati da camera per diverse fasi della vita. Visualizzati sono Dimensioni camera e ingrandimenti che sono utili per varie fasi ottimizzate per un chip telecamera 8 x 8 mm.

Representative Results

Microchambers Agarose possono essere applicati a qualsiasi fase della vita di C. elegans. Come si può vedere nella Figura 1A, sviluppo larvale e comportamento sonno durante L1 lethargus possono essere osservati. Vengono mostrati dimensioni delle camere che sono 190 x 190 micron, 10 micron di profondità. Se sono necessari tempi più lunghi, possono essere utilizzati camere più grandi. Come si vede in Figura 1B, utilizzando una camera di dimensioni maggiori (370 x 370 micron, 25 micron profondo) consente lo sviluppo di C. elegans da uovo fino adulto. Figura 1C mostra l'analisi dei cambiamenti a lungo termine nel comportamento con telaio sottrazione di un verme cresciuto in una camera da uovo fino adulta. Indicato sono intensità media dopo telaio sottrazione per raffiche selezionati durante veglia e lethargus. Minore è l'intensità media dopo valori telaio sottrazione è, minore è la mobilità del verme. Indicato sono selezionati scoppio tracce da una condizione veglia e una condizione lethargus per stadio larvale. Ilosservato aumento di intensità media durante lo sviluppo è dovuto principalmente alla maggiore contrasto e dimensioni dell'animale. figura 1D mostra una larva dauer, una fase di vita alternativo che opera in condizioni ambientali avverse 33. Formato da Camera è di 370 x 370 micron, 15 micron di profondità. Si noti che la larva Dauer è stata posta nella camera senza cibo batterica, che causerebbe l'uscita dalla fase larvale Dauer. La figura 1E mostra un verme adulto che ha già gettato molte uova nella camera. Dimensioni camera utilizzate per l'adulto sono 700 x 700 micron, 45 micron di profondità. Infine, la Figura 1F mostra un ermafrodita adulto e un accoppiamento maschio all'interno di una camera adulta. Calcio Imaging in vermi motilità è possibile con sensori di calcio GCaMP. Figure 2A, B spettacolo Imaging di calcio del comando interneurone AVA per una larva L1 27. Figure 2C, D mostrano l'attività di calcio per la sami tipo di neurone in un animale adulto. Scaling up di imaging a lungo termine è possibile attraverso la scansione e zoom out. Figura 3A mostra la qualità delle immagini delle immagini simultanea di 30 vermi su un unico chip fotocamera con una fotocamera da 5 megapixel. Figura 3B mostra la qualità dell'immagine di 4 vermi calcio ripreso contemporaneamente. Figura 1. Adeguamento della AMI a tutte le fasi della vita di C. elegans. (A) Larva ripreso dai primi di L1 fino all'inizio fase L2 in 190 x 190 micron camere. (B) per lo sviluppo da uovo fino adulto in una camera di 370 x 370 micron. (C) La mobilità di un worm valutata utilizzando telaio sottrazione. Viene mostrato l'intensità media di tutte le foto dell'immagine dopo telaio sottrazione di un film raffica selezionato per ogni sta larvalege per svegliarsi e comportamento lethargus. (D) Un dauer larva in assenza di cibo in una camera 370 x 370 um. Ermafrodita (E) per adulti con molte uova deposte in una camera di 700 x 700 micron. (F) L'accoppiamento di un maschio e una ermafrodita all'interno di una camera 700 x 700 um. YA significa giovane adulto. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 2. Imaging di calcio con IMA. (A) Calcio Imaging con GCaMP3 nel comando interneurone AVA di L1 larve utilizzando la NMR-1 promotore. Indicato sono due immagini a falsi colori. Nell'immagine di sinistra, l'attività di AVA è bassa e il verme non sta compiendo un movimento all'indietro. Nell'immagine a destra l'attività di AVA è alta, e il verme si muove all'indietro. transitori (B) di calcio nel corso del tempo per un worm L1. (C, D) transienti di calcio in un animale adulto. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 3. Imaging più vermi in parallelo con lo zoom out. (A) l'imaging simultaneo di 30 L1 vermi per fotogramma con 190 x 190 micron camere e un ingrandimento 100X (con un obiettivo 10X) e un chip di fotocamera 16,6 x 14 mm. (B) l'imaging simultaneo di quattro vermi L3 per fotogramma con 370 x 370 micron camere e 100X ingrandimento e una regione di interesse di un chip fotocamera 16,6 x 14 mm.et = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

Hardware

L'obiettivo di un microscopio tipicamente deriva durante l'acquisizione dell'immagine a lungo termine. Per microscopi composti, focus-mantenendo sistemi possono essere acquistati presso i maggiori produttori microscopio. Nel caso in cui un microscopio composto con controllo di fuoco è troppo caro, una semplice alternativa sarebbe quella di utilizzare uno stereomicroscopio. Microscopi composti consentono l'uso di obiettivi con alta apertura numerica (NA) e può essere facilmente automatizzato. Obiettivi olio 40X sono adatti. Lenti immersione in acqua non sono l'ideale per l'evaporazione durante l'imaging a lungo termine. Contrasto interferenziale differenziale (DIC) genera un piacevole contrasto che aiuta a seguire i cambiamenti morfologici e comportamentali, ma semplice per immagini campo luminoso può essere utilizzato anche. Per DIC o l'imaging campo chiaro, utilizzare la luce rossa posizionando un filtro di luce rossa nel percorso dia-illuminazione del microscopio. Per la scansione di diversi microchambers è necessaria una fase automatizzata. Miglior performance è achieved quando una fase è utilizzato che ha l'accelerazione lineare e decelerazione e può essere impostato a bassa velocità di scansione per evitare di disturbare gli animali durante la scansione. Non abbiamo osservato le risposte comportamentali o aumento di calcio nei neuroni meccanosensibili (ALM e PLM) durante la scansione, suggerendo anzi che la scansione lenta non attivare il sistema meccanosensibili del worm (dati non riportati). Sistemi commerciali LED possono essere utilizzate. Diverse aziende offrono soluzioni pronte per l'uso che comprendono i LED a diverse lunghezze d'onda. Il LED deve avere la possibilità di innescare esternamente LED con un segnale TTL. Una telecamera altamente sensibile è necessaria per l'imaging di calcio degli animali in movimento. Telecamere EMCCD sono le telecamere più sensibili sul mercato. La telecamera deve avere un'uscita TTL durante l'esposizione (detta anche output "fuoco"). Un riscaldatore coperchio è necessaria per evitare la formazione di condensa sul coperchio se si usa un microscopio invertito. Su un microscopio verticale, il piatto viene posizionato in modo che il coperchio will essere in basso e quindi la condensazione è impedito e non necessita riscaldamento coperchio. Il coperchio deve chiudere ermeticamente il piatto per evitare l'evaporazione di acqua durante l'imaging a lungo termine.

PDMS francobolli

La superficie del timbro PDMS che contiene la struttura per lo stampaggio l'agarosio è affrontato dal vetrino, che supporta il timbro PDMS. Una lista con le aziende che offrono chip microfluidici personalizzato può essere trovato su Wikipedia ( http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_microfluidics_related_companies ).

Riempimento dei nematodi nelle loro camere

Questa è la fase più critica del protocollo ei seguenti punti deve essere considerato: A) L'umidità del agarosio è fondamentale per trasferire i vermi e per l'imaging. Se l'agarosio è troppo umida, ossia, c'è una COV liquidorendo un'area di diversi microchambers, non sarà possibile distribuire cibo batterica e vermi in modo controllato perché il liquido farà batteri defluire. Se l'agarosio è troppo asciutto, quindi i batteri e vermi non possono scendere il pick facilmente il che significa che maggiore forza deve essere utilizzato per eliminare i vermi e batteri che causano facilmente danneggiare il agarosio. Nel compilare un sacco di vermi agarosio può asciugare. Nel peggiore dei casi l'agarosio sarà così asciutto alla fine che le camere crollerà. Se l'agarosio è troppo secca può essere reidratato mettendo una piccola goccia (circa 2 ml) di S-basale sul lato del chip dove non ci sono vermi. Poi immergere il filo di platino raccogliere nel liquido e anche tirare una parte del liquido nella zona in cui le camere sono piene di vermi. B) La quantità di cibo è fondamentale per il successo di imaging a lungo termine. Se non c'è abbastanza cibo, i vermi possono correre fuori di esso. Se c'è cibo eccessiva la cavità della cameranon si comporterà come un liquido, ma piuttosto come un solido e consentirà worm per fuggire dalla camera spingendo i batteri. Obiettivo per ottenere una sospensione batterica che riempie l'intera camera. I vermi sono in costante contatto fisico con la superficie di agar e vetro lungo la maggior parte della loro lunghezza durante l'esperimento e il comportamento strisciando sembra essere simile al movimento su un piatto e dissimile da thrashing in liquido. C) meccanica danneggiamento del agarosio può rovinare l'esperimento. Una bella scelta è essenziale. Non dovrebbe avere spigoli vivi. Un ciglia morbido attaccato ad una punta di pipetta può essere utilizzato per spostare batteri o vermi nelle camere invece di utilizzare un pick platino. Nella maggior parte dei casi, tuttavia, agarosio eccessiva asciugatura è la ragione per danni. Il pick o ciglia dovrebbero, idealmente, solo toccare appena l'agarosio in sé, e la pellicola d'acqua sulla superficie di agarosio dovrebbe tirare fuori i vermi e batteri. Quando sigillando le camere, di nuovo, l'umidità del agarosio è essenziale. Non ci dovrebbeessere qualsiasi liquido libero sulla superficie agarosio perché questo può lavare via i batteri e vermi durante la saldatura. Grandi bolle possono essere rimosse sollevando delicatamente un angolo della lastra agar. Piccole bolle che sono più piccole della camera spesso intrappolate all'interno delle camere. Queste bolle non sono un problema e spariranno per assorbimento. Dopo il montaggio del piatto, verificare ancora una volta che l'agarosio non è troppo secca o troppo umida. Le camere devono essere ben sigillati e non ci dovrebbe essere qualsiasi flusso di liquido tra le camere. Se l'agarosio è troppo bagnato, le camere non corretta tenuta. Worms possono sfuggire o il loro cibo sarà spazzato via. Se il campione è troppo umida, semplice aprire il coperchio e lasciare asciugare agarosio per un minuto o due. Se l'agarosio è troppo secca, le camere possono crollare e il worm si sfuggire.

Scaling da zoom out

Per l'imaging di fluorescenza, zoom indietro è limitata dalla scarsa quantità di luce ottenuta a visualizzazioni ridotte. Inoltre, ETelecamere MCCD sono ottimizzati per la sensibilità e spesso hanno una risoluzione relativamente bassa. Tuttavia, scaling up di immagini di quattro volte è ben possibile. Ad esempio, quattro camere di 190 micron x 190 micron può andare bene su un unico fotogramma utilizzando 140X ingrandimento (ottenuto utilizzando un 20X Obiettivo e una fotocamera 0,7X montaggio) e 512 x 512 pixel, 8 x 8 mm fotocamera. Una telecamera ad alta risoluzione con una grande chip (come macchine fotografiche sCMOS, 16,6 millimetri di chip x 14 mm, 2560 x 2560 pixel = 5.5 Megapixel) ottimizza scaling up di CID e di imaging in campo chiaro. Ad esempio, fino a 30 vermi L1 a 190 micron x 190 micron camere può andare bene su ogni fotogramma di questa fotocamera quando si utilizza un ingrandimento 100x (vedi figura 3). In linea di principio, lo zoom indietro e di scansione può anche essere combinati per ottenere anche un numero maggiore di animali. La maggior parte dei neuroni rimangono abbastanza bene a fuoco, in modo che solo un piano focale deve essere ripreso. Se i neuroni si trovano ad uscire dal fuoco, az scansione utilizzando un sistema piezoelettrico può essere presa in ogni momento pmista.

Adattamento ai diversi comportamenti

Questo protocollo dà una buona idea del comportamento attraverso scale temporali lunghe. Ovviamente, la tempistica delle esplosioni deve essere adattato alle differenti comportamenti e le fasi della vita.

Limitazioni della tecnica

Diversi fattori limitano la durata di imaging. La più importante è la quantità di cibo. Una volta che il cibo è consumato, larve fermare lo sviluppo. Così, in piccole camere (190 x 190 micron) vermi si sviluppano fino alla fase L3 e quindi arrestano. Se è necessario un tempo più lungo di imaging, camere grandi devono essere utilizzati. La durata massima delle immagini a lungo termine è nel range di 2,5 – 3 giorni. Se è richiesta l'imaging più, i vermi devono essere recuperati e inseriti in nuove camere. Quando l'imaging vermi adulti, un'altra limitazione è causata dalla progenie di questi worm. Worm adulte depongono le uova da cui larve si schiudono. Queste larve anche rimanere all'interno della camera, Consumare cibo, e possono disturbare l'analisi delle immagini. Se prole è un problema, una soluzione è usare sia per adulti sterili o per effettuare ripetutamente i vermi in camere fresche. Per recuperare i vermi, la lastra agarosio contenente la camera è tagliato gratuito con un bisturi, è tirato fuori dal vetrino, e viene posto su una piastra NGM da cui i worm possono essere recuperati. Un altro limite è la restrizione dei vermi per aree relativamente piccole. Questo può essere un problema se il movimento lungo raggio deve essere analizzato. Mentre gli animali nelle camere possono essere stimolati meccanicamente e optogenetically 21,27,34,35, la natura sigillata della camera renderà difficile applicare stimolanti solubili o volatili. Gas biologicamente importanti quali ossigeno o anidride carbonica possono diffondersi liberamente nel agar. Il grande serbatoio dell'aria nel piatto dovrebbe mantenere le concentrazioni di gas nelle camere di costanti lungo il tempo necessario per gli esperimenti. Tuttavia, va tenuto presente che la concentratio ossigeno localin nella camera può assomigliare più condizioni esistenti in coltura liquida di coltura su piastra.

Importanza rispetto ai metodi esistenti

Dispositivi microfluidici hanno notevolmente avanzato del comportamento e dello sviluppo studiato in C. elegans. Spesso, strutture microfluidica sono fatti di PDMS 12. Qui si descrive un protocollo per la generazione di camere di coltura di microfluidica a base di agarosio. La forza di questa tecnica è la combinazione di elevata qualità delle immagini, la correlazione di comportamento con misurazioni fisiologiche, immagini a lungo termine, e una portata ragionevolmente alto. Alta qualità di immagine si ottiene l'imaging attraverso il vetrino di vetro con obiettivi alti NA. Come risultato, imaging di fluorescenza come l'imaging calcio e confocale delle strutture subcellulari può essere eseguita. Poiché gli animali non sono immobilizzati come in altri sistemi, permette una correlazione di comportamento con misurazioni fisiologiche. Because gli animali hanno cibo abbondante, che continuare a sviluppare permettendo di imaging a lungo termine. Questo sistema è in grado di immagine molti worm in una corsa perché gli animali sono limitate nelle loro stanze definite. Così, questo metodo può essere facilmente scalato 9,27,34-36.

Le future applicazioni

Finora, questo sistema è stato utilizzato principalmente per studiare il comportamento di sonno in C. elegans L1 larve. Tuttavia, l'adattamento a tutte le fasi renderà possibile studiare una vasta gamma di comportamenti anche in dauers e adulti. Una vasta gamma di comportamenti può essere studiata con questa tecnica che vanno da accoppiamento per la deposizione delle uova.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Il Max Planck Society e uno stipendio Gottinga Graduate School Junior Gruppo HB finanziato questo lavoro.

Materials

high-melting point agarose Fisher Bioreagents BP(E)164-1000
Top Vision Low Melting Point Agarose Thermo Scientific R0801
LED system CoolLED pE-2
compound microscope Nikon TiE
stereomicroscope Leica M5
EMCCD camera Andor iXon 897 now sold as iXon Ultra 897
sCMOS camera Andor Neo
plasma cleaner Harrick PDC-23G2
lid heater MPI workshop custom made
plastic dish Falcon 08-757-100A
z-stage for the microscope Prior Nano Scan Z
x-y-stage for the microscope Prior Proscan III
PDMS stamp Abbott Laboratories  custom made
red light filter Chroma ET660/50m
35mm petri dish Falcon Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning
double sided sticky tape Sellotape/Henkel double sided 12mm x 33 m alternatively Advance double sided sticky tape from Rubance Adhesives can be used.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetica. 77, 71-94 (1974).
  2. Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook. , 1-17 (2012).
  3. Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E., Schafer, W. R. A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes. Nature Methods. 10, 877-879 (2013).
  4. Likitlersuang, J., Stephens, G., Palanski, K., Ryu, W. S. C. elegans tracking and behavioral measurement. Journal of Visualized Experiments : JoVE. , e4094 (2012).
  5. Yemini, E., Kerr, R. A., Schafer, W. R. Tracking movement behavior of multiple worms on food. Cold Spring Harbor Protocols. 2011, 1483-1487 (2011).
  6. Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in. C. elegans. Nature Methods. 8, 592-598 (2011).
  7. Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L., Carnell, L., Goodman, M. B. The Parallel Worm Tracker: a platform for measuring average speed and drug-induced paralysis in nematodes. PLoS One. 3, e2208 (2008).
  8. Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110, E4266-E4273 (2013).
  9. Bringmann, H. Agarose hydrogel microcompartments for imaging sleep- and wake-like behavior and nervous system development in Caenorhabditis elegans larvae. Journal of Neuroscience Methods. 201, 78-88 (2011).
  10. Yu, C. C., Raizen, D. M., Fang-Yen, C. Multi-well imaging of development and behavior in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience Methods. 223, 35-39 (2014).
  11. Luke, C. J., Niehaus, J. Z., O’Reilly, L. P., Watkins, S. C. Non-microfluidic methods for imaging live. C. elegans. Methods. 68, 542-547 (2014).
  12. San-Miguel, A., Lu, H. Microfluidics as a tool for C. elegans research. WormBook. , 1-19 (2013).
  13. Shi, W., Qin, J., Ye, N., Lin, B. Droplet-based microfluidic system for individual Caenorhabditis elegans assay. Lab Chip. 8, 1432-1435 (2008).
  14. Krajniak, J., Lu, H. Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies. Lab Chip. 10, 1862-1868 (2010).
  15. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
  16. Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of. C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
  17. Suzuki, H., et al. In vivo imaging of C. elegans mechanosensory neurons demonstrates a specific role for the MEC-4 channel in the process of gentle touch sensation. Neuron. 39, 1005-1017 (2003).
  18. Hilliard, M. A., et al. In vivo imaging of C. elegans ASH neurons: cellular response and adaptation to chemical repellents. EMBO Journal. 24, 63-72 (2005).
  19. Frokjaer-Jensen, C., et al. Effects of voltage-gated calcium channel subunit genes on calcium influx in cultured C. elegans mechanosensory neurons. Journal of Neurobiology. 66, 1125-1139 (2006).
  20. Kerr, R. A. Imaging the activity of neurons and muscles. WormBook. , 1-13 (2006).
  21. Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim, R., Tsien, R. Y. Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 96, 2135-2140 (1999).
  22. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19, 137-141 (2001).
  23. Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6 (2), (2013).
  24. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6, 875-881 (2009).
  25. Edwards, S. L., et al. A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 6, e198 (2008).
  26. Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nat Neurosci. 11, 916-922 (2008).
  27. Turek, M., Lewandrowski, I., Bringmann, H. An AP2 transcription factor is required for a sleep-active neuron to induce sleep-like quiescence in. C. elegans. Current Biology. 23, 2215-2223 (2013).
  28. Singh, K., et al. C. elegans Notch Signaling Regulates Adult Chemosensory Response and Larval Molting Quiescence. Current Biology. 21, 825-834 (2011).
  29. Raizen, D. M., et al. Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state. Nature. 451, 569-572 (2008).
  30. Iwanir, S., et al. The microarchitecture of C. elegans behavior during lethargus: homeostatic bout dynamics, a typical body posture, and regulation by a central neuron. Sleep. 36, 385-395 (2013).
  31. Nagy, S., Raizen, D. M., Biron, D. Measurements of behavioral quiescence in Caenorhabditis elegans. Methods. , (2014).
  32. Nagy, S., et al. A longitudinal study of Caenorhabditis elegans larvae reveals a novel locomotion switch, regulated by Galphas signaling. eLife. 2, e00782 (2013).
  33. Cassada, R. C., Russell, R. L. The dauerlarva, a post-embryonic developmental variant of the nematode Caenorhabditis elegans. Biologia dello sviluppo. 46, 326-342 (1975).
  34. Schwarz, J., Lewandrowski, I., Bringmann, H. Reduced activity of a sensory neuron during a sleep-like state in Caenorhabditis elegans. Current Biology. 21, R983-R984 (2011).
  35. Schwarz, J., Spies, J. P., Bringmann, H. Reduced muscle contraction and a relaxed posture during sleep-like Lethargus. Worm. 1, 12-14 (2012).
  36. Schwarz, J., Bringmann, H. Reduced sleep-like quiescence in both hyperactive and hypoactive mutants of the Galphaq Gene egl-30 during lethargus in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 8, e75853 (2013).

Tags

Calcium ImagingCaenorhabditis ElegansAgarose MicrochambersLong-termComportamentoNeural ActivityEMCCDParallel Imaging

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Turek, M., Besseling, J., Bringmann, H. Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (100), e52742, doi:10.3791/52742 (2015).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image