Etichettatura Viral-mediata e trapianto di Medial gangliari Eminenza (MGE) Celle per<em> In Vivo</em> Studi
Summary
GABAergici progenitori degli interneuroni corticali disperdono, sviluppare e sinapticamente integrarsi in una corteccia di accoglienza dopo il trapianto. Queste cellule possono essere facilmente trasdotte prima del trapianto per gli studi in vivo di precursori GABAergici geneticamente modificati. Qui, vi mostriamo le tecniche di etichettatura virale per indirizzare specifici sottogruppi di interneuroni utilizzando linee Cre esistenti e giornalisti Cre-dipendenti.
Abstract
GABAergici interneuroni corticali, derivati dalla mediale embrionale e eminenze gangliari caudale (MGE e EGC), sono funzionalmente e morfologicamente diversificato. Incursioni sono stati fatti nella comprensione dei ruoli di distinti sottogruppi di interneuroni corticali, tuttavia, ci sono ancora molti meccanismi da elaborati che possono contribuire allo sviluppo e la maturazione dei diversi tipi di cellule GABAergici. Inoltre, la segnalazione GABAergici alterata può contribuire a fenotipi di autismo, la schizofrenia e l'epilessia. Specifiche linee Cre driver hanno cominciato a spartire le funzioni di sottogruppi interneuroni unici. Nonostante i progressi nella modelli murini, è spesso difficile da studiare in modo efficiente GABAergici progenitori degli interneuroni corticale con approcci molecolari in vivo. Una tecnica importante usata per studiare la cellula di programmazione autonoma di queste cellule è il trapianto di cellule MGE in corteccia di accoglienza. Queste cellule trapiantate migrano ampiamente, differenziarsi, unND funzionale integrazione. Inoltre, le cellule possono essere efficacemente MGE trasdotte con lentivirus immediatamente prima del trapianto, consentendo una moltitudine di approcci molecolari. Qui abbiamo i dettagli di un protocollo di trasdurre efficientemente cellule MGE prima del trapianto per l'analisi in vivo, utilizzando disponibili linee Cre-driver e vettori di espressione Cre-dipendenti. Questo approccio è vantaggioso perché unisce manipolazione genetica preciso con la capacità di queste cellule di disperdersi dopo il trapianto, permettendo una maggiore risoluzione specifico tipo cellulare in vivo.
Introduction
GABAergici interneuroni corticali costituiscono ~ 20-30% dei neuroni nella neocorteccia dei mammiferi, mentre il resto corrisponde a eccitatori, principali neuroni glutamatergici. Interneuroni sono molto diverse nelle proprietà elettrofisiologiche, assoni e dendriti morfologia e sinaptica mira 1, e gli squilibri in eccitatoria tono / inibitorio Si ipotizza che alla base di alcuni fenotipi di disturbi neuropsichiatrici / neurologici, tra cui l'autismo, la schizofrenia e l'epilessia 2. L'obiettivo generale del protocollo qui descritto è quello di fornire un mezzo per modificare in modo efficiente geneticamente GABAergici progenitori degli interneuroni corticali prima del trapianto in vivo per le analisi.
Interneuroni GABAergici corticale nascono in eminenze gangliari mediale e caudale (MGE e CGE, rispettivamente) 3,4, così come la zona preottica 5. Progenitori degli interneuroni corticali sottoposti seguita a lunga distanza di migrazione tangenzialedalla migrazione radiale per raggiungere i loro obiettivi finali. All'arrivo a destinazione, questi interneuroni corticali devono integrarsi correttamente nella rete neuronale esistente, e ogni sottogruppo interneurone unica contribuirà alla circuiteria corticale in modi specifici. Quattro sottogruppi principali possono essere distinti da marcatori molecolari: somatostatina MGE-derivato (SST) + e parvalbumina (PV) + sottogruppi, e CGE-derivati peptide intestinale vasoattivo (VIP) + e Reelin +; SST – sottogruppi 6. Diversi sottogruppi interneuroni corticali sono nati più di momenti diversi durante lo sviluppo embrionale nel MGE e CGE 7, 8. Questi e altri corticali marcatori interneuroni GABAergici sono stati utilizzati per generare specifiche linee di Cre-driver per molti di questi sottogruppi 9-11.
Il trapianto di progenitori MGE è emersa come una terapia cellulare potenziale per il trattamento di disturbi che possono essere causati da squilibriin eccitazione / inibizione 12 – 24. Questi benefici terapeutici possono essere dovuti in parte alla capacità unica di progenitori MGE (per disperdere, differenziare e integrare in un cervello host), o potenzialmente perché molti peri-somatiche PV inibitorio + cellule derivano dalla MGE. Cellule MGE possono anche essere rapido ed efficiente trasdotte con lentivirus prima del trapianto 15, consentendo alle cellule che sono geneticamente modificati in vitro da studiare in vivo. Il razionale per lo sviluppo di questo approccio è stato quello di superare i blocchi stradali in studio GABAergici sviluppo interneuroni corticale e la maturazione. In particolare, MGE il trapianto ha permesso ai ricercatori di studiare lo sviluppo di cellule mutanti in vivo, quando il mouse mutante avrebbe altrimenti morto in un punto di tempo in anticipo. Inoltre, introducendo geni di interesse prima del trapianto, gli effetti di geni specifici su un fenotipo mutante possono essere valutati in un effmaniera icient.
Qui, forniamo un protocollo dettagliato per trasdurre cellule MGE con lentivirus prima del trapianto. Inoltre, si mostra come questa tecnica può essere adattato per esprimere un gene di interesse in specifici sottogruppi di interneuroni da un gruppo eterogeneo di precursori degli interneuroni corticali, utilizzando una combinazione di lentivirus espressione Cre-dipendenti e disponibili linee del mouse Cre-driver. Inoltre, questo protocollo introduce tecniche e una piattaforma per i ricercatori di modificare geneticamente GABAergici precursori degli interneuroni corticali per studi in vivo in un modo unico. Un vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri approcci attuali è che le cellule trapiantate MGE si disperderanno di distanza dal sito di iniezione. Inoltre, a differenza di iniezioni virali focali, dopo che le cellule MGE disperdono la loro morfologia è più facile da valutare. Questo approccio può essere usato per studiare l'effetto di introdurre geni di interesse in tipo selvatico o mutante cellule, introducendo un tipo di cellula specificogiornalista per valutare la morfologia, o potenzialmente per studiare l'effetto della malattia alleli in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'uso di precursori degli interneuroni GABAergici corticale dalle eminenze gangliari embrionali (GES) per le terapie cellulari basate sta mostrando la promessa per molte condizioni 12 -1 4. Sono necessarie tecniche molecolari precisi per monitorare, ed esprimere geni di interesse in specifici sottogruppi di interneuroni. Qui forniamo un protocollo dettagliato per etichettare le cellule MGE embrionali con lentivirus prima del trapianto e mostriamo come questa tecnica può essere usata per esprimere geni di…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni a JLRR da: Autism Speaks, Nina Irlanda, Weston Havens Foundation, NIMH R01 MH081880, e NIMH R37 MH049428. PRW è stato sostenuto da una borsa di studio dal National Science Council di Taiwan. SFS è stato sostenuto da F32 (MH103003).
Materials
| Reagents and equipment for MGE cell transplantation | |||
| 1 ml syringe | REF 309602 | BD, Becton Dickinson and company | |
| 301/2 gauge needle | 305106 | BD, Becton Dickinson and company | |
| Precision bore to deliver 5 µl (comes with plunger) | 5-000-1005 | Drummond scientific company | |
| Parafilm | PM-999 | Polysciences, Inc. | |
| Stereo microscope with boomstand ** | MZ6 | Leica | |
| Digital just for mice stereotaxic instrument ** | 51725D | Stoelting company | |
| Single-axis oil hydraulic fine micromanipulator ** | MO-10 | Narishige | |
| Diamond coated rotary beveler | n.a. | made in house | |
| Needle pipette puller | 730 | Kopf instruments | |
| Mineral oil | n.a. | Any drug store or pharmacy | |
| Any pipette and tips that can reliaby measure 1 µl of volume | |||
| ** These are the particular models we use, but many other setups should work | |||
| Optional Reagents (for making Lentiviruses) | |||
| 25 mm, 0.45 µm filter | 09-719B | Fisher Scientific | |
| Ultra-clear centrifuge tubes (25 x 89 mm) | 344058 | Beckman Coulter® | |
| Lipofectamine 2000 (1.5 ml size) | 11668019 | Invitrogen | |
| Other commercially available supplies | |||
| pMDLg/pRRE plasmid encoding gag/pol | 12251 | Addgene | |
| pRSV-Rev plasmid encoding Rev | 12253 | Addgene | |
| pMD2.G plasmid encoding VSVG | 12259 | Addgene | |
| pAAV-Flex-GFP | 28304 | Addgene | |
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