Untersuchung von Blut Zellpopulationen des<em> Drosophila melanogaster</em> Larva
Summary
Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.
Abstract
Bei Wirbeltieren ist der Hämatopoese durch induktive Mikroumgebungen (Nischen) geregelt. Ebenso in der wirbellosen Modellorganismus Drosophila melanogaster, induktive Mikroumgebungen als Larven Hematopoietic Pockets (HPS) gewusst haben, wie anatomischen Stellen für die Entwicklung und Regulierung der Blutzellen (Blutzellen), insbesondere der sich selbst erneuernden Makrophagen-Linie identifiziert. HPs sind segmentally wiederholt Taschen zwischen der Epidermis und Muskelschichten der Larven, die auch sensorischen Neuronen des peripheren Nervensystems umfassen. In der Larve werden Resident (sessile) Hämozyten an anti-apoptotischen, Klebstoffs und proliferative Signale aus diesen sensorischen Neuronen und möglicherweise anderen Komponenten HPS wie die Auskleidung Muskel und Epithelschichten belichtet. Während der normalen Entwicklung, allmähliche Freisetzung Wohnsitz Blutzellen aus den HPs Kraftstoffe die Bevölkerung der zirkulierenden Blutzellen, die in der Veröffentlichung von mo gipfeltst der residenten Blutzellen zu Beginn der Metamorphose. Immunangriffe, des Körpers oder mechanische Störung auslösen, die vorzeitige Freigabe von inländischen Blutzellen in den Verkehr. Der Schalter der Larven Hämozyten zwischen gebietsansässigen Standorte und Kreislauf erhöht den Bedarf nach einem gemeinsamen Standard / Verfahren, um selektiv zu isolieren und zu quantifizieren, diese zwei Populationen von Blutzellen aus einzigen Drosophila-Larven. Dementsprechend Dieses Protokoll beschreibt eine automatisierte Methode, um freizugeben und zu quantifizieren, die Bewohner und zirkulierenden Blutzellen aus einzelnen Larven. Das Verfahren erleichtert ex-vivo-Ansätzen, und kann angepasst sein, eine Vielzahl von Entwicklungsstadien von Drosophila und anderen wirbellosen Organismen zu dienen.
Introduction
Forschung in der wirbellosen Modell Drosophila melanogaster hat die Entdeckung der angeborenen Immunität 1 angetrieben wird, und hat das Verständnis der verschiedenen Aspekte der Blutzellentwicklung 2-4. Drosophila Hämatopoese in die Linie der embryonalen / Larvenblutzellen, die in der Ursprung unterteilt werden erleichtert Embryo und in der Larve zu erweitern, und die Abstammung von Lymphdrüsen Hämozyten 4,5. Hier präsentieren wir ein Protokoll, das auf der Linie der embryonalen / Larvenblutzellen, die in der Drosophila Larve umfasst im Wesentlichen plasmatocytes (Makrophagen) und einige Kristallzellen 4 fokussiert. In der Larve, Blutzellen des Embryos fortbestehen und zu kolonisieren segmentweise wiederholt und Terminal Hematopoietic Pockets (HPS) zwischen der Epidermis und Muskelschichten des Larvenkörperwand 5,6 entfernt. Auf der Grundlage ihrer Natur als selbst erneuernde Makrophagen 6, ihrer überwiegenden Aufenthalt in lokalen Gewebemikroumgebungen 6, 7 und ihrer Abstammung von den frühesten Blutkörperchen Schwellen während der Entwicklung 6,8 wird diese Blutzellpopulation, die als ähnlich wirbel selbsterneuernden Gewebsmakrophagen, einem unabhängigen myeloider Abstammung kurzem in einer Vielzahl von Arten 4,9,10 identifiziert. Jedoch di Drosophila, einige oder alle dieser residenten Zellen zeigen auch Plastizität Anlass zu anderen Arten von Blutzellen, wie beispielsweise Kristallzellen 11,12 ergeben.
Larvenblutzellen sind überwiegend ansässig (sessile), sondern in einem dynamischen stationären zwischen verschiedenen HPs. Sie werden nach und nach in Verkehr gebrachten, insbesondere in der 3. Larvenstadium nähert Puparium 5-7. Immune Herausforderungen, Verletzungen oder mechanische Störung führen zu einer vorzeitigen, im letzteren Fall reversibel, Mobilisierung der Wohnsitz Blutzellen in die Hämolymphe 4,6,13.
Frühere Studien haben gezeigt, dass ansässige vorgeschlagen und zirkulierendeLarvenblutzellen sind von der gleichen Linie, unterscheiden sich aber in ihren Klebstoff oder Homing Eigenschaften 6,7,13,14. Selektive Isolierung von zirkulierenden gegen Wohnsitz Hämozyten ergab erhöhte Konzentrationen von Proliferation in der Wohn hemocyte Bevölkerung, was auf ihre Exposition gegenüber induktiven Hinweise aus HPS 6. Drosophila Larven HPs werden von Epidermis und Muskelschichten ausgekleidet und weitere Hafen sensorischen Nervenzellverbände des peripheren Nervensystems (PNS) und Leberfunktion ähnlich oenocytes 6. Funktionell Mutante und genetische Zellablation Experimente haben gezeigt, dass in den vorliegenden HPs sensorischen Neuronen unterstützen die trophischen Überleben und die Lokalisierung von Larven Hämozyten 6.
Hier beschreiben wir ein Verfahren für die spezifische Isolierung und Quantifizierung von gebietsansässigen und zirkulierenden Blutzellen aus einem Drosophila-Larven, und ein Protokoll für mechanischen hemocyte Mobilisierung. Die Verfahren können für die ex vivo verwendet werden,Untersuchung von Blutzellen und kann weiter zu anderen Drosophila Entwicklungsstadien wie die Puppe und Erwachsenen und andere wirbellose Systeme angepasst werden. Da frühere Studien nicht zwischen gebietsansässigen und zirkulierenden Blutzellen zu unterscheiden, bietet dieses Protokoll einen gemeinsamen Standard für das Studium der Wohnsitz Blutkörperchen und wird dazu beitragen, um die Konsistenz der wirbellosen Blutzellforschung zu erhöhen.
Zunächst beschreibt der Hemocyte Bleed / Scrape Assay der differentiellen Isolierung und automatische Quantifizierung von fluoreszierenden Protein markierte Wohnsitz und zirkulierenden hemocyte Populationen von einzelnen Drosophila-Larven; Das Protokoll bietet zwei Optionen für die regelmäßige und Fliesen scannen ausgestattete Mikroskope (Abbildung 1). Als Ergebnis ist der Anteil der zirkulierenden Blutzellen und die Gesamtzahl der Blutzellen pro Larve erhalten. Das Verfahren beruht auf transgene Drosophila-Larven, die fluoreszierende Protein unter ihren Blutzellen exprimierenBevölkerung. Die Wahl der hemocyte Fahrer oder Reporter bestimmt das Ergebnis, das heißt, die Bevölkerung von Blutzellen sichtbar gemacht und quantifiziert. Um vor allem kenn Makrophagen (plasmatocytes), die die überwiegende Mehrheit der Bewohner und zirkulierenden hemocyte Bevölkerung der Drosophila Larve 6 umfassen, geeignet Transgene umfassen Hml Δ-DsRed 6, HmlΔ -GAL4 15. Pxn -GAL4 16, CRQ-GAL4 (durch H. Agaisse 16) oder eater-GAL4 17; für die Kennzeichnung des relativ kleinen Population von Kristallzellen, geeignete Leitungen BcF6-CFP und -GFP 18 oder LZ-GAL4 (von J. Pollock 19); für die Kennzeichnung Lamellozyten, einem spezialisierten Zelltyp vor allem durch Immun Herausforderungen und Verletzungen 13 induziert, zB MSNF9mo-mCherry verwendet 17 werden. Einige transgene Treiber sind in einer Reihe von differenzierten Blut ausgedrücktZellen und Vorläuferzellen, wie er – GAL4 20, die etwa 80% aller Larven Blutkörperchen 20 Etiketten. Bitte beachten Sie, dass in allen Fällen, in denen GAL4-Treiber verwendet werden, zusammen mit UAS-GFP oder einem anderen fluoreszierenden Proteins UAS-Transgens erforderlich ist. Im Abschnitt Ergebnisse, wird dieses Verfahren verwendet, um Blutzellzahl und Zirkulationsverhalten im Laufe der Larvenentwicklung überwachen.
Zweitens beschreibt die Hemocyte Disturbance Assay einen vorhergehenden Schritt zur resident Hämocyten durch externe Manipulation, das anschließend ermöglicht die Bewertung der Fähigkeit von Hämozyten neu zu haften und die Heimat HABn innerhalb eines begrenzten Zeitrahmen zu lösen (30-60 min) 6. Regel dieser Assay wird durch die Bleed / Scrape Test, um den Anteil der zirkulierenden Blutzellen pro Larve bestimmen. Wir präsentieren ein vereinfachtes Protokoll für diesen Assay (1D), die Störung durch Vortexen wit verwendeth Glasperlen, anstatt Manipulation einzelner Larve mit einem Pinsel wie zuvor 6 beschrieben. Im Abschnitt Ergebnisse, ist dieser Assay verwendet werden, um die vorübergehend abgelöst hemocytes Schwimmer in der Hämolymphe zu zeigen und können in dem Bruchteil der zirkulierenden Blutzellen zurückgewonnen werden. Der Test ist auch nützlich, um Unterschiede der Blutzellen in ihrer Homing / Haftung an Wohnsitz Websites vergleicht zB verschiedene genetische Hintergründe oder Stimulationsbedingungen zu quantifizieren. Bitte beachten Sie, dass diese mechanische Manipulation reflektiert einen reversiblen Prozess und unterscheidet sich von Infektions- oder Verletzung induzierte resident hemocyte Mobilisierung, die typischerweise nicht reversibel sind in einem kurzen Zeitrahmen 4,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir die erste Methode zur quantitativen erholen Wohnsitz und zirkulierenden Blutzellen aus einzigen Drosophila-Larven, und zu quantifizieren, diese beiden hemocyte Populationen. Das Protokoll enthält die sequenzielle Freisetzung von zirkulierenden und Resident Blutzellen, gefolgt von bildgebenden und automatisierte Zellzählung. Larven Wohnsitz Hämozyten kann vorübergehend durch mechanische Störung in Umlauf mobilisiert werden, ein Prozess, der dafür bekannt ist, größtenteils innerhalb von 30 umgekehrt werden – 60 Minuten Erholungszeit 6. Dementsprechend wurde dieses Protokoll auf zwei Arten getestet: (1) durch die Ermittlung des Gesamt hemocyte Zahl pro Larve und Fraktion von zirkulierenden Blutzellen im Laufe der Entwicklung der Larven, und (2) durch experimentell Verdrängen resident hemocytes Verwendung eines automatisierten Verfahrens, was bestätigte, das enge Korrelation hemocyte Lokalisierung und hemocyte Nummer in der gebietsansässigen und zirkulierenden Populationen. Darüber hinaus wurde die Reproduzierbarkeit des Verfahrens durch Co zeigtenmparing zwei Datensätze von biologischen Replikaten.
In der Vergangenheit haben die Labors eine Reihe von Techniken zur Larven Hämozyten 6,13,21 quantifizieren. Dieses Protokoll wird ein gemeinsamer Standard abzurufen und zu quantifizieren, Bewohner und zirkulierenden Blutzellpopulationen aus Drosophila-Larven und bietet eine leicht anpassbare Plattform. Das beschriebene Verfahren ist entscheidend für die Studien, die über die Rolle der residenten Blutzellen und ihrer Mikroumgebung zu konzentrieren, die hämatopoetischen Pockets 4-6, und ist geeignet, um fluoreszierende Protein Transgen tragenden Drosophila-Stämmen in Wildtyp und gentechnisch veränderten Hintergründe zu untersuchen. Das Protokoll ist auch für Studien, die auf hemocyte Mobilisation nach Immun Herausforderung oder Verletzungen, und genetisch oder umweltbedingten Signalisierung, die Mobilisierung der Wohnsitz Blutzellen oder Veränderungen in der Gesamt hemocyte Nummer (4 Bewertung) löst konzentrieren relevant. Es sollte beachtet werden, dass in Fällen der vorzeitigen differentiation und Freisetzung von Blutzellen aus der Lymphdrüsen und unterscheidet embryonale / Larvengegen Lymphdrüse Abstammungslinien können durch die Expressionsmuster der Fluoreszenz hemocyte Reporter verwendet begrenzt werden.
Die hier vorgestellte Protokoll stützt sich auf Echtzeit-Bildgebung, fluoreszenzmarkierten Blutzellen. In der Zukunft kann es modifiziert werden, um den Nachweis von freigesetzten Zellen nach der Fixierung zu ermöglichen, beispielsweise mittels Immunzytochemie. In diesem Fall kann es für das Protokoll, das geeignet ist, um eine vollständige Haftung der Blutzellen, beispielsweise durch Erhöhung Adhäsion Inkubationszeiten und Hinzufügen Klebe Gleitbeschichtung, beispielsweise Concanavalin A sicherzustellen da die Methode eine Abfrage von Hämozyten und deren Manipulation ex vivo, es wird eine breite Palette von Entwicklungs, zellbiologische und biochemische Untersuchungen profitieren. Einwohner und zirkulierenden Blutzellen werden bei allen postembryonalen Entwicklungsstadien von Drosophila und andere wirbellose 22, suggesti gefundenng, dass die Anpassung dieser Methode wird eine breite Palette von Studien über die Drosophila-Larven blutbildenden Systems zu profitieren.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir bedanken uns bei Jesper Kronhamn und Dan Hultmark, Michael Galko und die Bloomington Stock Center für die Fliege Aktien. Besonderer Dank geht an Courtney Onodera um Rat bei der statistischen Analyse. Wir danken Katrina Gold für die kritische Durchsicht des Manuskripts und Kalpana Makhijani, Katrina Gold, Mitglieder der Derynck Labor, und die Mitglieder der Nystul Labor für Diskussionen und Anmerkungen zum Manuskript. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem UCSF Programm für Breakthrough Biomedical Research (PbBr), Broad Center, Hellman-Stiftung, American Cancer Society RSG DDC-122595, American Heart Association 13BGIA13730001, National Science Foundation 1.326.268, National Institutes of Health 1R01GM112083-01 und unterstützt 1R56HL118726-01A1 (um KB).
Materials
| 6cm/9cm Petri dishes | One for each genotype to be evaluated | ||
| Water squirt bottle | |||
| Metal spoon/spatula | |||
| Thin paintbrush | e.g. a "liner" | ||
| Glass cavity dish | |||
| PAP pen: Super PAP PEN IM3580 | Beckman Coulter | ||
| Glass slides | Each slide will have 5 or more PAP PEN squares drawn on them. Size of squares depends on the imaging objective and magnification of the microscope camera; e.g. 2mm squares. | ||
| Moist chamber | This will be used to prevent slides and wells from drying out: sealed container with wet paper towels lining the sides/bottom | ||
| Schneider’s Drosophila cell culture media | Invitrogen | ||
| Cold block | This is a metal block (a.k.a. heating block) chilled in bucket containing ice; preferably black-colored or other dark, non-reflective color | ||
| Two 1ml syringes with needles (27G ½) | Becton Dickinson | For dissections. | |
| Optional: Surgical spring scissors (cutting edge 2mm) | Fine Science Tools | ||
| Glass beads, 212-600 micron | Sigma | ||
| 2 ml Eppendorf tubes | Eppendorf | One per genotype evaluating | |
| Vortex Mixer | Fisher Scientific | ||
| Transgenic Drosophila larvae with fluorescently marked hemocytes. Suitable transgenes include: HmlΔ-DsRed (Makhijani et al., 2011), MSNF9mo-mCherry (Tokusumi et al., 2009), BcF6-CFP and -GFP (Gajewski et al., 2007), or HmlΔ-GAL4 (Sinenko and Mathey-Prevot, 2004), Pxn-GAL4 (Stramer et al., 2005), He-GAL4 (Zettervall et al., 2004), Crq-GAL4 (by H. Agaisse (Stramer et al., 2005)), or eater-GAL4 (Tokusumi et al., 2009) combined with UAS-GFP or other fluorescent protein transgenes. | |||
| Fluorescence dissecting microscope | Leica | Here: Leica M205, optional with camera, imaging software and measuring module | |
| Inverted fluorescence microscope with camera attachment | Leica or Keyence | With or without tile scanning function (eg. Leica DMI series, Keyence BIOREVO BZ-9000 series) |
Riferimenti
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