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Medicina

Alta frecuencia de imágenes por ultrasonido del mouse ganglios linfáticos cervicales

Published: July 25, 2015
doi:
10.3791/52718
, ,
1Department of Neurobiology and Anatomy,West Virginia University, 2Animal Models and Imaging Facility,West Virginia University, 3Mary Babb Randolph Cancer Center,West Virginia University

Summary

Este protocolo describe la aplicación de ultrasonidos de alta frecuencia (HFUs) para obtener imágenes del ratón ganglios linfáticos cervicales. Esta técnica optimiza la visualización y cuantificación de la morfología de ganglio linfático cervical, el volumen y el flujo de sangre. Biopsia guiada por imágenes de los ganglios linfáticos y el procesamiento de tejido linfático para la evaluación histológica del cuello del útero también se demuestra.

Abstract

De alta frecuencia de ultrasonido (HFUs) es ampliamente empleado como un método no invasivo para obtener imágenes de estructuras anatómicas internas en sistemas animales experimentales pequeños. HFUs tiene la capacidad de detectar estructuras tan pequeñas como 30 micras, una propiedad que se ha utilizado para la visualización de los ganglios linfáticos superficiales en los roedores en el brillo (B) -mode. La combinación de Doppler de potencia con formación de imágenes en modo B permite medir el flujo sanguíneo circulatorio dentro de los ganglios linfáticos y otros órganos. Mientras HFUs se ha utilizado para obtener imágenes de los ganglios linfáticos en un número de sistemas modelo de ratón, no se ha informado un protocolo detallado que describe HFUs de formación de imágenes y la caracterización de los ganglios linfáticos cervicales en ratones. Aquí, mostramos que HFUs puede adaptarse para detectar y caracterizar los ganglios linfáticos cervicales en ratones. En modo B y Doppler combinado de energía se pueden utilizar para detectar aumentos en el flujo de sangre en los ganglios cervicales inmunológicamente agrandados. También describe el uso de imágenes en modo B para realizar biopsias con aguja fina de la linfa cervicales sindes para recuperar el tejido linfático para el análisis histológico. Por último, se describen los pasos de software asistido para calcular los cambios en el volumen de los ganglios linfáticos y visualizar los cambios en la morfología de nodo linfático siguientes reconstrucción de la imagen. La capacidad de controlar visualmente los cambios en la biología ganglio linfático cervical en el tiempo proporciona una técnica simple y poderosa para la monitorización no invasiva de alteraciones de los ganglios linfáticos cervicales en modelos preclínicos ratón de la enfermedad de la cavidad oral.

Introduction

El drenaje linfático de líquido intersticial del tejido es el principal método de difusión para los microorganismos infecciosos y los cánceres que surgen en la región oral y maxilofacial 1,2. La evaluación clínica de los ganglios linfáticos cervicales es una práctica común de diagnóstico utilizado para determinar la presencia o la progresión de las enfermedades que se originan en la cavidad oral. Esto pone de relieve la importancia de la recogida de los ganglios linfáticos cervicales como valiosos sitios anatómicos para el diagnóstico de enfermedades orales 3. Varias metodologías de imagen especializados están clínicamente utilizados para la identificación de los ganglios linfáticos cervicales enfermas. Estos incluyen la tomografía por emisión de positrones (PET), tomografía computarizada (TC) y la resonancia magnética (RM). Mientras altamente valioso, todos estos métodos requieren extensa preparación del paciente, equipo altamente especializado y / o infusión químico en la circulación para permitir o mejorar el proceso de formación de imágenes.

De imagen ecográfica (ultrasonido; Estados Unidos) es una técnica comúnmente aplicada utilizado para imganglios linfáticos cervicales de edad que presentan linfadenopatía debido a una infección o afectación metastásica 4-6. Estados Unidos a menudo se combina con PET-TC y la RM para proporcionar una representación completa del estado de los ganglios linfáticos del paciente, ayudando a determinar la estadificación del tumor y la necesidad de la extirpación quirúrgica 7. La naturaleza no invasiva de Estados Unidos también tiene ventajas inherentes sobre otras modalidades de imagen, incluyendo la facilidad de uso, bajo coste, la incomodidad del paciente mínima y preparación. La ubicación subcutánea superficial de la mayoría de los ganglios linfáticos cervicales permite estadounidense para guiar las biopsias por aspiración con aguja fina de mínima invasión con una mayor precisión, mejorando la precisión de diagnóstico 8.

Alta frecuencia Comercial (HF) de Estados Unidos ofrece una resolución detallada de las estructuras anatómicas internas a 30 micras 9. El uso de transductores que van desde 22 hasta 70 MHz, HFUs se ha aplicado fácilmente a una variedad de sistemas de roedores experimentales para permitir imágenes en tiempo real de los órganos internos en vivo.; HFUs ha sido adaptado para la visualización de la formación de tumores en -mode convencional brillo (B), así como con un número de agents9 general y especializada mejora de contraste. Utilizando Doppler de potencia con HFUs proporciona la capacidad de controlar el flujo sanguíneo dentro de los tumores de ratón, lo que permite una evaluación completa de la perfusión angiogénico en ratones en vivo 10,11. HFUs se ha utilizado para visualizar ganglios linfáticos de ratón enfermas dentro de la cavidad del cuerpo principal, lo que demuestra la utilidad de esta tecnología en paralelo a la práctica clínica. En particular, inflamatorios y metastásicos alteraciones de los ganglios linfáticos visceral se han observado en modelos de ratón de cáncer de mama que alberga 12,13, pancreáticas 14, colorrectal y de pulmón 15 16 tumores, así como histocytomas fibrosas 17, y un modelo de ratón envejecido de hidronefrosis adquirido 18 . Estos ejemplos se solidifican el valor de HFUs como una poderosa herramienta de investigación para linfadenopatía inducida por tumor en una amplia variedad de rosistemas de Dent.

Varios modelos de infección bacteriana 19,20 y de cabeza y cuello, carcinoma de células escamosas (HNSCC) 21,22 se han desarrollado para estudiar estas enfermedades en el entorno preclínico. A diferencia de los humanos, los ratones contienen tres ganglios linfáticos cervicales que encuesta linfa de los tejidos orales de la cavidad (mandibular, mandibular submandibular y parótida superficial 23). Recientemente, se informó el uso de HFUs al mapa la ubicación y morfología de estos ganglios linfáticos, seguimiento de los cambios en el volumen de los ganglios linfáticos y el flujo sanguíneo en un modelo de ratón inducida por carcinógeno de CECC 24. Aquí, ofrecemos un protocolo detallado para el uso de HFUs para la identificación, tratamiento de imágenes y el análisis de los ganglios linfáticos cervicales en ratones vivos. Este protocolo también demuestra la viabilidad de utilizar HFUs realizar imagen- biopsia con aguja fina guiada de ratón ampliada ganglios linfáticos cervicales, lo que permite el monitoreo histológico de cambios en el contenido de los ganglios linfáticos cervicales y patologías más de tIME en el mismo animal. Este protocolo es fácilmente adaptable para permitir el estudio detallado de los ganglios linfáticos cervicales patologías resultantes de cualquier enfermedad invasiva cavidad oral en ratones.

Protocol

Todos los animales procedimientos demostrados en este protocolo se han revisado y aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Virginia Occidental en virtud de los protocolos 11-0412 y 14-0514 y realizadas de conformidad con los principios y procedimientos descritos en la Guía del NIH para el Cuidado y Uso de animales. 1. Preparación Animal Anestesiar un solo ratón en una cámara de inducción usando 3% isofluorano mezclado con 1,5 L / min 100% de oxígeno. Retire el animal de la cámara de inducción y el lugar en una posición supina sobre la plataforma de imágenes precalentado a 40 ° C y se mantuvo entre 37-42 ° C (Figura 2A). Confirmar la anestesia por la falta de respuesta a una pizca dedo del pie. Coloque el hocico del ratón dentro de la ojiva conectado al sistema de anestesia. Aplicar la anestesia para mantener la sedación en estado estacionario (1,5% isofluorano mezclado con 1,5 L / min 100% de oxígeno). Aplicar lubricante ocular el cada ojo para evitar drying. Aplicar gel electrodo a los electrodos y el uso de cinta adhesiva para asegurar cada una de las cuatro patas al electrodo correspondiente. Los electrodos transmitirán ECG del animal para el sistema de imágenes para permitir el monitoreo de la frecuencia cardíaca y la frecuencia respiratoria. Lubrique e inserte la sonda de temperatura rectal para el monitoreo continuo de la temperatura corporal. La temperatura normal del cuerpo del ratón es de 36,9 ° C. 2.1 ° C de variación es normal, mientras que bajo anestesia. Use crema depilatoria para eliminar la piel desde el cuello del ratón. Enjuague la región del cuello con una gasa empapada en agua para eliminar el vello y el exceso de crema depilatoria. Opcionalmente, utilice la aplicación adicional de la crema depilatoria para eliminar el vello corporal restante (Figura 2B). 2. Identificación y adquisición de imágenes de ratón cervical ganglios linfáticos Usando HFUs Para empezar, aplicar una capa de gel de ultrasonido calentado a la zona del cuello desprovisto de piel. Utilice la aplicación liberal de gel para una imagen óptimacalidad (Figura 2C). Evitar la introducción de burbujas de aire en el gel durante la aplicación, lo que puede interferir con la formación de imágenes ultrasónicas. Ajuste la plataforma de imágenes 20-30 ° por lo que el ratón se coloca con la cabeza ligeramente elevada. Esta posición ayuda a asegurar la tasa de respiración óptima para el ratón. Coloque el transductor 40 MHz transversalmente en el sistema de montaje y cuidadosamente bajarlo hasta que el frente de la cabeza de exploración del transductor se sumerge en el gel de ultrasonido (Figura 2C). NOTA: Asegúrese de no poner demasiada presión sobre el cuello del ratón, ya que podría causar dificultad respiratoria indebida. Además, es útil para la imagen de tener un buffer de gel entre el transductor y el ratón. Imaging B-Mode y detección de los ganglios linfáticos: El uso de la computadora que controla el software de adquisición HFUs, ajustar el brillo (B) los ajustes del modo a los siguientes parámetros: Ganancia 22 dB, profundidad 10,00mm, ancho de 14.08 mm. NOTA: Estos ajustes son un punto de partida sugirieron, y pueden requerir ligero ajuste para la adquisición de imagen óptima entre diferentes aplicaciones. Observar los ganglios linfáticos cervicales normales como estructuras hipoecoicas ovales cerca de la superficie de la piel dentro de un campo hiperecoico circundante. La aparición de los ganglios linfáticos enfermos puede variar entre modelos. Para sistemática imagen todos los ganglios linfáticos en la región del cuello utilice los siguientes pasos: Utilice el eje Y para escanear el cuello en un craneal a caudal manera hacia la región torácica. Utilice el eje X para centrar la imagen. Identificar los principales puntos de referencia: la cavidad bucal, la lengua y la glándula tiroides (Figuras 3A, B y C; respectivamente); inclinar la plataforma de imágenes para ajustar horizontalmente la superficie ventral del cuello del ratón, haciendo ambos lados del cuello aparecen incluso en la imagen en modo B. La cantidad de inclinación depende de la fisiología de cada ratón individual. </li> Llevar a cabo una exploración 3D de toda la región del cuello de la región de la cavidad / lengua bucal a la glándula tiroides, con el fin de mapear los ganglios linfáticos y puntos de referencia asociados a lo largo del cuello. Localice la región lengua / bucal cavidad (Figura 3A) y anote la ubicación numérica en la escala Y. Busque glándula tiroides (Figura 3C) y anote la ubicación numérica en la escala Y. Calcular la diferencia entre los valores obtenidos en (2.4.1) y (2.4.2) para determinar la longitud total en mm para la región del cuello de imágenes. Utilice el mando Y para centrar el transductor en el punto medio de la longitud total determinada. Pulse el botón "3D". Introduzca la longitud total. Para el tamaño de paso 3D, utilice 0,076 mm para adquirir la pila de serie de imágenes para toda la región del cuello. Una vez finalizado el escaneo, seleccione el lado derecho o izquierdo del cuello y centrar el transductor en un ganglio linfático individual de interés, entonces elevar el 4Transductor 0 MHz fuera el ratón. Retire el transductor de 40 MHz y reemplazarlo con un transductor Microscan 50 MHz (también en una posición transversal) para obtener imágenes de mayor resolución. Reponer el gel de ultrasonido en el cuello del ratón y bajar el transductor de 50 MHz en el gel de ultrasonido. 3D Poder Doppler Imaging Conducta 3D escanea con power Doppler para evaluar el volumen y la vascularización de los ganglios linfáticos cervicales individuales de la siguiente manera: Pulse el botón de encendido en el teclado del sistema para adquirir Dopper poder y ajustar la configuración de modo de poder siguientes: PRF 4 KHz, Doppler ganancia de 34 dB, 2D ganancia de 30 dB, profundidad 5,00 mm, ancho de 4,73 mm. NOTA: Como antes, estas configuraciones son un punto de partida sugerido y puede ser modificado según sea necesario para la adquisición de imagen óptima en varios modelos. Busque el punto más craneal de los ganglios linfáticos de interés y anote la ubicación en la escala Y. Busque el punto más caudal del mismo nodo y la notala ubicación en la escala Y. Calcular la diferencia de distancia para determinar la longitud total de los ganglios linfáticos (véase el paso 2.4.3). Centre el transductor en el punto medio de la longitud total determinada, utilizando la ubicación Y-escala. Pulse el botón "3D" y escriba longitud total de los ganglios linfáticos. Utilice 0.051 mm para el tamaño del paso. NOTA: Debido a la proximidad del transductor a la región del pecho, el transductor 50 MHz puede resultar en una imagen Doppler inestable debido a la detección de movimiento respiratorio normal. Esto puede ser eliminado mediante el uso de la opción "Respiración Gating" disponible en la pestaña "fisiológica". Rodean el ganglio linfático seleccionado con el cuadro amarillo que designa la región para ser analizados por Doppler de potencia y seleccione "escaneo 3D" para adquirir imágenes. Elevar el transductor fuera del ratón y moverlo hacia el lado opuesto del cuello. Baje el transductor en el ratón y repita los pasos descritos anteriormente para imaganglios linfáticos ge en este lado del cuello. Guardar conjuntos de imágenes para su posterior análisis. 3. cervical biopsia del ganglio Seleccione el nodo linfático deseada para la biopsia y mantener imágenes HFUs con el transductor de 50 MHz. Elegimos el ganglio linfático cervical visible más grande en cada lado del cuello ratón. Inflamación de ganglios linfáticos normalmente indica una respuesta inflamatoria, y por lo tanto este tipo de nodos son candidatos ideales para la biopsia. NOTA: Hemos encontrado que es muy difícil de llevar a cabo biopsias de ganglios cervicales menor que 10 mm 3. Preparar la aguja y una jeringa para la biopsia mediante la colocación de una jeringa de 1 ml con un adjunto 27 G, la aguja de 0,5 pulgadas en el soporte de jeringa. Ajuste el soporte de la aguja para orientar la aguja 90 ° en el cuello del ratón (Figura 4A). Preparar mediante la elevación de toda la plataforma de ratón para el nivel de la aguja. Lograr esto quitando el motor 3D y cambiar a un platf más altoorm, o colocando un objeto sólido de altura adecuada bajo la plataforma corto proporcionado. Utilice un estante de tubo de microcentrífuga de plástico para este propósito. Si es necesario, girar la plataforma 180 ° con el fin de nodos de biopsia situados en el lado del cuello opuesto al aparato de aguja. Ajuste los valores de adquisición seleccionando "Preferencias" y luego seleccionando "Max & búfer extendido". Ampliar el campo de visión hasta una profundidad de 8,00 mm y la anchura de 9,73 mm. Encienda la guía de la aguja marque utilizando las teclas de la pantalla. La guía de la aguja será predecir la trayectoria de la aguja en la pantalla y permite al usuario alinear el ganglio linfático de interés en la ubicación correcta para biopsia. Asegúrese de que el ganglio linfático se mantiene constantemente a la vista centrando el ganglio linfático en el medio o ligeramente a la izquierda del centro de la pantalla (Figura 4B). Para obtener todo el bucle de cine del procedimiento, pulse Pre-gatillo en el teclado del sistema antes de comenzar la biopsia. Ajuste el soporte de la aguja hasta que la punta de la aguja entra en la visión y en contacto con la piel (Figura 4B). Avanzar la aguja con una empresa, empuje rápido para punzar la piel. Continuar para avanzar la aguja hasta que la punta también perfora la cápsula (Figura 4C) y es visible dentro de la médula (Figura 4D). Una vez que la aguja se encuentra adecuadamente dentro del nodo, tire suavemente el émbolo de la jeringa hacia atrás entre los 200 a 300 demarcaciones mu l para realizar la biopsia (Figura 4D y 4E). Tenga en cuenta que el material de biopsia normalmente no es visible dentro de la jeringa. Retire con cuidado la aguja del cuello ratón. Expulsar a los contenido de la jeringa en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Retire la aguja de la jeringa, dejando la aguja en el tubo. Recoge 1 ml de medio de biopsia (de una parte alícuota, separados de la fuente de la acción) con la misma jeringa, y luego vuelva a colocar la aguja de la jeringa, manteniendo la aguja in thtubo e. Enjuague la jeringa y la aguja con los medios de biopsia por expulsar a los medios de biopsia en el tubo. NOTA: No tire del émbolo mientras la aguja está unido en cualquier momento después de la biopsia. Esto reduce el riesgo de perder el material de biopsia debido al pequeño tamaño de la muestra. Confirmar linfático contenido nodo mediante histológicos (Figura 4F) y analizar por métodos adicionales (histoquímica, citometría de flujo, etc.), según corresponda. Una vez que la biopsia es completa, apague la anestesia y retire la sonda de temperatura rectal. Retire el exceso de gel de ultrasonido de ratón con una gasa y quitar la cinta de cada pata. Retire el ratón desde la plataforma de imágenes y volver a una jaula. Se puede producir sangrado mínimo de sitio de la biopsia, pero esto deja sin intervención. Monitorear el ratón durante la recuperación hasta que se reanude la actividad completa. 4. Análisis de Imágenes de los ganglios linfáticos cervicales <li> En el software de ultrasonido, seleccione la imagen para el análisis y vaya a la pestaña "Procesamiento de imágenes". Seleccione la opción "Cargar en 3D". Seleccione "3D Reconstruido de imagen" en la esquina superior izquierda, al hacer clic en el botón "Mostrar panel individual". Utilice la función de zoom para agrandar la imagen si lo desea. Toggle "Diseño de la pantalla" para ver la imagen sólo en B-mode, que elimina la superposición power Doppler de la vista. Esto hace que sea más fácil de ver los bordes de los ganglios linfáticos durante el análisis posterior 3-D. Desplazarse a través de la serie de imágenes para localizar el comienzo de los ganglios linfáticos. Para circunscribir el ganglio linfático, vaya a la pestaña "Configuración de 3D". Seleccione "volumen", luego en el botón "Inicio" al lado de "Paralelo". Dibuja los contornos de todo el área de interés dentro de las imágenes individuales desplazándose. Continúe hasta que las imágenes que abarcan todo el ganglio linfático se marcan. Seleccione la opción "Finalizar" paracompletar el análisis. En la parte inferior de la imagen, se mostrará automáticamente el volumen y% 3D vascularidad. NOTA: 3D volumen corresponde al volumen de los ganglios linfáticos, y el porcentaje de la vascularización representa el porcentaje del ganglio linfático positivo para el flujo de sangre por Doppler de potencia. Toggle "Diseño de la pantalla" para ver la imagen Doppler de potencia como una superposición en la imagen del modo B-. En la vista de la superficie observar una vista de red de la zona de volumen de interés. Exportar las imágenes en el archivo de imagen (TIF) en formato 3D o exploraciones etiquetados como películas (.avi) para su uso posterior.

Representative Results

El esquema general de los procedimientos de imagen y biopsia se muestra en la Figura 1. Los pasos clave en el procedimiento incluyen la preparación adecuada del ratón para la imagen, la identificación de los ganglios linfáticos cervicales, correcta preparación y realización de la biopsia con aguja, y el análisis de B -MODE y Doppler imágenes para medir el volumen y la cantidad de la vascularización dentro de cada nodo seleccionado utilizando los programas informáticos. HFUs de formación de imágenes de ratón ganglios linfáticos cervicales requiere la aplicación y el mantenimiento de la anestesia adecuada durante todo el período de formación de imágenes (Figura 2A), así como la eliminación completa del pelo que cubre toda la zona del cuello (Figura 2B). La aplicación liberal de gel de ultrasonido para la región depilada asegura una señal HFUs clara durante el procedimiento (Figura 2C). HFUs imágenes de la región del cuello es ayudado por la visualización de puntos de referencia anatómicos cervicales que producen imágenes ecográficas característicos. Figura3 muestra ejemplos de los órganos principales (Figura 3A-C), los ganglios linfáticos cervicales en modo B (Figura 3D) y en el modo Doppler (Figura 3E). HFUs imágenes en tiempo real en los ratones anestesiados permite la biopsia con aguja fina guiada linfáticos cervicales similares a lo que se lleva a cabo en la práctica clínica. La colocación de la aguja de biopsia y jeringa colección adjunta al equipo microinyector de control se muestra en la Figura 4A. Modo B subsiguiente imágenes ecográficas muestran la colocación ideales aguja antes de la biopsia (Figura 4B), entrada punta de la aguja en un ganglio linfático cervical (Figura 4C), y la posición de la aguja durante la biopsia (Figura 4D). Imagen de primer plano muestra la punta de la aguja dentro de la médula del ganglio linfático (Figura 4E). Procesamiento de los componentes de biopsia por cytospin revela abundantes racimos de células linfoides y el tejido conectivo asociado, la verificación de los ganglios linfáticos éxitobiopsia (Figura 4F). Basado en el análisis computacional de imágenes HFUs permite que se obtenga información detallada acerca de la arquitectura de los ganglios linfáticos, el volumen y el flujo vascular. Uso del modo Doppler poder y mediciones de volumen 3D, ciento vascularización (PV) se puede calcular a partir de series de imágenes que abarcan la totalidad de los nodos (Figura 5A). Además, las imágenes en 3D permite la reconstrucción virtual de los ganglios linfáticos, revelando la topografía general de los ganglios linfáticos (Figura 5B). Figura 1:. Descripción esquemática de las etapas implicadas en HFUs diagnóstico linfático cervical imágenes nodo en ratones Los pasos clave incluyen 1: Preparación de los ratones para imágenes HFUs y obteniendo 40 y 50 imágenes de resolución MHz de la región del cuello que contiene los tres ratón ganglios linfáticos cervicales . 2: la biopsia con aguja fina guiada por imagen de los ganglios linfáticos cervicales y posterior análisis histológico de material de biopsia. 3: análisis de imagen asistido por ordenador y la reconstrucción 3D de imágenes de ganglios linfáticos obtenidos en modo B y Doppler para determinar el volumen de los ganglios linfáticos respectivo y porcentaje (%) de flujo vascular. Figura 2:. Descripción de la alta resolución del sistema de micro-imágenes in vivo para la evaluación de los ganglios linfáticos del cuello uterino y la biopsia en (A) El sistema HFUs se muestra con un ratón anestesiado preparado para la imagen de los ganglios linfáticos cervicales. También se muestra la microinyector (MI) y la etapa 3D-motor equipo accesorio (MS 3D). (B) Cierre de vista de un ratón anestesiado preparado para imágenes HFUs con el pelo retirado de la región del cuello. (C) El mismo ratón con el transductor 50 MHz en su lugar en el cuello. Tenga en cuenta el gel de ultrasonido adicional utilizado para facilitar la región de imágenes cuello. 718fig3.jpg "/> Figura 3: HFUs Representante imágenes de anatomía cervical en modo B y Doppler de potencia. (A, B) imágenes en modo B de la cavidad oral, mostrando la cavidad bucal (BC) y la lengua (T) se visualizó mediante la formación de imágenes más cercana a la cavidad nasal. Los tres ganglios linfáticos cervicales se encuentran a cada lado del cuello (etiquetados M, mandibular; SM, submandibular; SP, parótida superficial), aparece como un grupo de estructuras hipoecoicas en un solo plano de formación de imágenes como se muestra (B). (C) La glándula tiroides (Th) como se visualiza en la región torácica superior, que aparece como una estructura en forma de mariposa sólida, ecogénica. (AC) se visualizaron con un transductor de 40 MHz; barra de escala = 1 mm. (D, E) Imágenes representativas de lo normal (D) y ampliados (E) los ganglios linfáticos cervicales con modo B y Doppler de potencia (rojo). Las líneas de puntos perfilan los ganglios linfáticos individuales. La barra de escala = 0,5 mm. <img alt="Figura 4" src = "/ files / ftp_upload / 52718 / 52718fig4.jpg" /> Figura 4: Cervical biopsia del ganglio linfático configuración, las imágenes y el análisis citospina de material de biopsia (A) La plataforma de imágenes que muestra la micro-inyector y colocación de la aguja cerca del cuello del ratón.. Una amplia bastidor de tubo de microcentrífuga (bloque naranja) se utiliza para elevar ligeramente la plataforma, lo que permite la colocación correcta de la aguja mientras que todavía permite espacio para la etapa-motor 3D. Esta disposición reduce al mínimo el tiempo pasado la eliminación de la fase del motor para cada ratón. (B – D) Total imágenes HFUs cuello tomadas de un video de una biopsia de los ganglios linfáticos del cuello uterino mediante el transductor de 50 MHz. Imagen en modo B HFUs que muestra la aguja colocada a un lado del cuello antes de la biopsia (B). La punta de la aguja es la estructura hiperecoico justo debajo de la posición de la guía de la aguja (línea punteada verde) superpuesta durante la exploración para indicar la trayectoria de la aguja. El ganglio linfático se encuentra en el centro dela imagen. La barra de escala = 1 mm. (C) entrada de la aguja en el ganglio linfático. (D) La biopsia del ganglio linfático cervical. (E) Zoomed biopsia de ganglio linfático cervical. La barra de escala = 0,5 mm. Análisis (F) Cytospin de material de biopsia de la linfa representante confirmando biopsia éxito. Barra de escala = 100 micras. Figura 5:. El análisis por ordenador de imágenes de nódulos linfáticos cervical 3D (A) de pantalla Representante de un ganglio linfático analizaron utilizando software de ordenador. El nodo se circunscribe en azul; Los resultados del análisis muestran volumen 3D y porcentaje vascularización (PV) como se indica. Una imagen de vista de la superficie del mismo nodo después de análisis 3D (B). Renders todo volumen de los ganglios linfáticos en base a las mediciones realizadas en A.

Discussion

El protocolo descrito permite la visualización y en la evaluación in situ de los ganglios linfáticos cervicales murinos utilizando imágenes de HFUs no invasiva. El uso de modo B y de formación de imágenes Doppler de potencia para visualizar la morfología cervical de los ganglios linfáticos, el volumen y los ganglios linfáticos flujo sanguíneo proporciona para un análisis experimental de los sistemas de modelo de ratón preclínicos similares a los usados ​​para la caracterización de los nodos de pacientes cervicales en la práctica clínica. La capacidad de monitorear los ganglios linfáticos cervial vía biopsia con aguja fina también proporciona una técnica útil para la detección de alteraciones de células inmunes y la presencia de tipos de células extrañas o bacterias durante adenopatías inducida por enfermedades de la cavidad oral, en ratones. La facilidad de uso y bajo costo asociado con HFUs permite la detección rápida de estado de los ganglios linfáticos cervicales en una amplia variedad de modelos animales.

Un paso crítico en este protocolo es la identificación éxito inicial de los ganglios linfáticos cervicales en imágenes HFUs. Nuestra instalación cuenta con un surtido de tran HFUssducers como describen, por lo que los hemos utilizado para obtener las imágenes de mayor calidad. Sin embargo, si los transductores que describimos no están disponibles, es posible adaptar la formación de imágenes usando otros transductores. Para este propósito, el ajuste de profundidad y ancho de la imagen para obtener una imagen adecuada es todo lo que se requiere. La resolución de este tipo de imágenes puede variar, pero aún debe ser posible obtener imágenes de alta calidad mediante el uso de HFUs. Imaging puntos de referencia de la cavidad oral y de la glándula tiroides que ayuda enormemente en la orientación al usuario de la región adecuada en donde se localizan los ganglios linfáticos. La forma ovalada, la naturaleza y la ubicación hipoecoica característica superficial cerca de la superficie de la piel permite la rápida identificación de confirmación de los ganglios linfáticos cervicales dentro de la región apropiada cuello. Mientras que todos los tres nodos pueden ser visibles en un solo plano de la imagen (Figura 3B), típicamente uno o dos nodos son capturados durante obtención de imágenes. Pequeños ajustes de la posición del transductor pueden llevarse a cabo para desgarrarer diferente de imágenes Planos visible, lo que permite la visualización de todos los nodos en un solo lado del cuello.

Si bien hemos encontrado la técnica descrita fiable para la identificación de los ganglios linfáticos cervicales, existen limitaciones específicas a la técnica de imagen y biopsia. La naturaleza superficial de ratón ganglios linfáticos cervicales confiere excesiva movilidad cuando se aplica incluso una ligera presión a la piel a través de la cabeza del transductor. Esto puede ser contrarrestado mediante la aplicación lentamente el cabezal del transductor en el gel de ultrasonido sobre el cuello del ratón hasta que se identifican las imágenes señal. La movilidad de los ganglios linfáticos también puede complicar la biopsia con aguja fina, especialmente cuando se utilizan transductores en la resolución más alta (50 MHz) Rango. Centrado imágenes de los ganglios linfáticos de la biopsia son típicamente empujado fuera del campo de visión debido a la fuerza de la aguja de biopsia necesaria para perforar la piel suprayacente y la cápsula. Esto puede remediarse mediante el posicionamiento fuera del centro del ganglio linfático hacia la dirección de entrada de la aguja,proporcionar un espacio para el ganglio linfático a ser empujado a través de, pero todavía permanecen dentro del campo de visión durante la biopsia. En nuestra experiencia, los ganglios linfáticos> 10 mm 3 son muy difíciles de biopsia, ya menudo son empujados por la aguja en lugar de penetrar durante el avance de la aguja. Por lo tanto, la biopsia es mejor reservarlo para los ganglios linfáticos agrandados en el que el tamaño es> 10 mm 3 para asegurar suficiente tamaño y la estabilidad de destino nodo dentro de la región cervical. Además, el material de la biopsia no puede contener el número de células suficientes para los procedimientos donde se requiere el número de células más grandes (por ejemplo, citometría de flujo).

HFUs se ha utilizado con éxito para visualizar HNSCC ortotópico tumores 25, y tiene el potencial para monitorizar metástasis en los ganglios de cuello uterino en ratones con tumores orales 24. Además de ultrasonido, imágenes de bioluminiscencia también se ha utilizado para visualizar la formación de tumor por vía oral ortotópico y cervical metástasis en los ganglios linfáticos en ratones vivos 26,27. Como alternenfoque ative, imágenes de bioluminiscencia tiene una clara ventaja sobre HFUs en ser capaz de cuantificar directamente la progresión del tumor y la carga metastásica en el tiempo en el mismo animal. Mientras innegablemente útil, imágenes de bioluminiscencia es incapaz de medir muchos de los parámetros visualizados por HFUs, incluyendo la morfología de los ganglios linfáticos, los volúmenes nodales o el flujo sanguíneo. Imágenes de bioluminiscencia también requiere cajas oscuras especializados para mantener los ratones durante la exploración, lo que hace esta técnica inadecuada para la adaptación de la biopsia con aguja fina.

Además, imágenes de bioluminiscencia requiere la producción de las células tumorales que expresan de forma estable la enzima luciferasa, lo que permite esta técnica para ser utilizado sólo en casos de xenoinjertos ortotópico con células tumorales transfectadas luciferasa en ratones inmunodeprimidos o con sistemas transgénicos específicos de tejido inducibles que restringen la expresión de luciferasa de una manera espacio-temporal específica para el tejido de origen tumoral. En contraste, HFUs puede ser used en conjunción con imágenes de bioluminiscencia en estos modelos, así como ser capaz de visualizar los ganglios linfáticos cervicales en modelos de tumores orales inducidos por carcinógenos en ratones con sistemas inmunes completos 28,29. Mientras HFUs puede ser más adaptable a la mayoría de los modelos de ratón de cáncer oral, la información combinada que se puede obtener a partir de la bioluminiscencia y HFUs de imágenes en sistemas donde las células tumorales expresan luciferasa puede proporcionar una imagen más completa de la afectación ganglionar cervical que sea la modalidad de imagen solo.

La capacidad para identificar y detectar ratón ganglios linfáticos cervicales en tiempo real permite esta técnica para ser utilizado en la mayoría de los modelos de la enfermedad oral que resultan en linfadenopatía inflamatoria donde el animal puede ser mantenido en una posición invertida bajo anestesia a corto plazo. La detección de metástasis en los ganglios linfáticos o infección bacteriana y el impacto concomitante en la morfología de los ganglios linfáticos en animales vivos presenta una ventaja significativa sobre los métodos tradicionalesque requieren los ganglios linfáticos a ser removidos de animales muertos para el procesamiento histológico. Combinando HFUs con biopsia con aguja fina permite un medio para la realización de análisis patológico de rutina de los ganglios linfáticos cervicales, similar a lo que se lleva a cabo en la clínica, proporcionando un método mejorado para el seguimiento de la progresión de la enfermedad en la mayoría de los modelos actuales de ratón de enfermedades de la cavidad oral.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por el fondo de Dorothy D. Radford Dotación del Centro de Cáncer de la Universidad Randolph María Babb Virginia Occidental. El uso de los modelos y de imagen West Virginia University Animal Fondo (AMIF) y el Fondo de imágenes de microscopía (FOMIN) (apoyado por el RR16440 subvenciones P20 María Babb Cancer Center Randolph y NIH, RR032138 P30 / GM103488 y S10 RR026378) Se agradece.

Materials

Vevo2100 High Resolution Micro-ultrasound Imaging System, with integrated software Version 1.6.0 VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada VS-11945
Power Dopper Mode and 3D Mode VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada VS-11952; VS-11484
Vevo compact anesthesia system VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada
Vevo integrated rail system including 3D motor and micromanipulator for injections VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada SA-11983
Thermasonic Gel Warmer VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada Optional
Transducers – MS-550D (Broadband frequency: 22 MHz – 55 MHz) VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada VS-11960 Referred to as 40 MHz Transducer
Transducers – MS-700 (Broadband frequency: 30 MHz – 70 MHz) VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada VS-12026 Referred to as 50 MHz Transducer
Ophthalmic Ointment Patterson Veterinary 07-888-1663
Electrode gel Parker Laboratories 174-1525
Tape Medical Arts Press 174-153000
Depilatory Cream Carter Products
Cotton swabs General Supply
Gauze Fisher Scientific 22-037-907
Water General Supply
Lubricating gel Parker Laboratories 57-05
Ultrasound gel Parker Laboratories 01-50
Microcentrifuge tube rack General Supply Used to raise mouse platform for optimal biopsy position
27G ½ inch needle with 1 ml syringe Fisher Scientific 14-826-87
ThinPrep PreservCyt Solution Hologic 70097-002 Refered to as biopsy media
Microcentrifuge tubes General Supply
Thinprep 2000 processor Cytyc, Marlborough, MA Blue Filter
Olympus AX70 Provis Microscope Olympus, Center Valley, PA
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Riferimenti

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Walk, E. L., McLaughlin, S. L., Weed, S. A. High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes. J. Vis. Exp. (101), e52718, doi:10.3791/52718 (2015).
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