マウス子宮頸部リンパ節の高周波超音波イメージング

このプロトコルで実証すべての動物の手順を見直し、プロトコル11から0412と14から0514の下でウェストバージニア大学動物実験委員会によって承認され、管理と使用のためのNIHガイドで概説した原理および手順に従って実施されてきました動物の。 1.動物の準備 1.5 L /分、100％の酸素を混合し、3％イソフルランを使用して誘導チャンバ内で単一のマウスを麻酔。 40℃に予熱し、37-42℃の（ 図2A）との間に維持イメージングプラットフォーム上で仰臥位で誘導チャンバーと場所から動物を削除します。つま先のピンチへの応答の欠如によって麻酔を確認します。 麻酔システムに接続されたノーズコーン内でマウスの鼻の位置を調整します。定常状態の鎮静（1.5リットル/分、100％の酸素と混合した1.5​​％イソフルラン）を維持するために麻酔を適用します。 dryin防ぐために目の潤滑剤をインクルードそれぞれの目を適用しますgです。電極に電極ゲルを適用し、対応する電極に4足のそれぞれを確保するためにテープを使用します。電極パッドは、心拍数と呼吸数のモニタリングを可能にするために、撮像システムに動物のECGを送信します。注油と体温を連続的に監視するための直腸温度プローブを挿入します。正常マウスの体温は36.9℃です。 1-2℃の変動は麻酔下にある間は正常です。 マウスの首から毛を除去するために、脱毛クリームを使用してください。髪や過剰な脱毛クリームを除去するために水に浸したガーゼでネック領域をすすぎます。必要に応じて、残りの体毛（ 図2B）を除去するために、脱毛クリームの追加のアプリケーションを使用します。 2.識別とHFUSを用いてマウス子宮頸部リンパ節の画像取得開始するには、毛皮を欠い首領域に加温し超音波ゲルの層を適用します。最適な画像のためのゲルのリベラルなアプリケーションを使用します品質（ 図2C）。超音波画像を妨害することができるアプリケーション、中にゲル内に気泡を導入することは避けてください。 イメージングプラットフォームので、マウスをわずかに高いヘッドで配置されている20〜30度を調整します。この位置は、マウスに最適な呼吸速度を確保するために役立ちます。実装システムで横方向に40 MHzのトランスデューサーを配置し、トランスデューサスキャンヘッドの前を超音波ゲル（ 図2C）に浸漬されるまで、慎重にそれを下げます。 注：それは過度の呼吸困難を引き起こす可能性があるとして、マウスの首の上に過剰な圧力をかけないようにしてください。また、トランスデューサとマウス間のゲルのバッファを持って撮影に便利です。 リンパ節のBモード·イメージングおよび検出： HFUS取得ソフトウェアを制御するコンピュータを使用して、次のパラメータに明るさ（B-）モードの設定を変更する：ゲイン22デシベル、深さ10.00ミリ、幅14.0​​8ミリメートル。 注：これらの設定は、出発点を示唆しており、異なるアプリケーション間で最適な画像取得のための若干の調整が必要な場合があります。周囲高エコーフィールド内の皮膚表面に近い楕円形の低エコー構造として、通常の頸部リンパ節を観察します。罹患リンパ節の外観はモデル間で変化することができます。体系的にイメージがネック領域内のすべてのリンパ節は、次の手順を使用するには： 胸部に向けての方法を尾側する頭蓋に首をスキャンするために、Y軸を使用してください。画像を中央にX軸を使用してください。 主要なランドマークを特定します。口腔、舌、および甲状腺（ 図3A、BおよびC;それぞれ）。水平首の両側にも、Bモード画像で表示されながら、マウスの首の腹側表面を調整する撮影台を傾けます。チルトの量は、個々のマウスの生理機能に依存します。 </lI> 首全体にリンパ節および関連するランドマークをマッピングするために、甲状腺に口腔/舌領域から全体ネック領域の3次元スキャンを実施します。 舌/口腔領域（ 図3A）を見つけて、Yスケールの数値場所を確認します。 甲状腺（ 図3C）を見つけて、Yスケールの数値場所を確認します。 （2.4.1）において得られた値の間の差を計算し、（2.4.2）撮像さ頸部用mm単位の合計長さを決定します。 決定された全長の中間点に変換器を中心にYノブを使用してください。 を押して「3D」。全体の長さを入力します。 3Dステップサイズについては、全体のネック領域の画像シリーズのスタックを取得するために0.076ミリメートルを使用しています。 スキャンが完了すると、次に4を上げ、首の右側または左側を選択して、関心の個々のリンパ節にトランスデューサを中心マウスオフ0 MHzのトランスデューサ。 40 MHzの変換器を取り外し、高解像度の画像を得るために（も横位置での）50 MHzのマイクロスキャン変換器を交換してください。マウスの首に超音波ゲルを補充し、超音波ゲルに50 MHzのトランスデューサを下げます。 3Dパワードップラーイメージング以下のように個々の頸部リンパ節のロバのボリュームと血管分布にパワードップラーで3Dスキャンを実施します： プレスシステムキーボードの電源ボタンパワードプラを取得し、以下の省電力モードの設定を調整するには：PRF 4キロヘルツ、ドップラーが34デシベル、2D利得30デシベル、深さ5.00ミリメートル、幅4.73ミリメートルを得ます。注：前述のように、これらの設定が提案出発点であり、様々なモデルにおける最適な画像取得のために必要に応じて変更することができます。 興味のあるリンパ節の頭蓋最もポイントを見つけて、Yスケール上の位置に注意してください。 同じノードおよびノー​​トの最も尾側の点の位置を確認しますYスケール上の位置。 リンパ節の全体の長さを決定するための距離差を計算する（ステップ2.4​​.3を参照）。 Yスケールの場所を使用して、決定された全長の中間点に変換器を中央に配置します。 を押して「3D」と総リンパ節の長さを入力します。ステップサイズの0.051ミリメートルを使用してください。 注：これにより胸部への変換器の近くに、50 MHzのトランスデューサは、通常の呼吸運動の検出に起因する不安定なドップラー画像になることがあります。これは、「生理​​」タブの下で入手可能な「呼吸ゲーティング」オプションを使用して除去することができます。 パワードップラーにより分析し、画像を取得するための「3Dスキャン」を選択する領域を指定黄色のボックスで選択されたリンパ節を囲みます。マウスのオフ変換器を持ち上げ、首の反対側に移動します。マウスへの変換器を下げて、IMAに上記の手順を繰り返し首のこちら側のGEのリンパ節。 その後の分析のための画像セットを保存します。 3.子宮頸部リンパ節生検生検のための所望のリンパ節を選択し、50 MHzのトランスデューサとHFUSイメージングを維持します。マウスの首の両側で最大の可視頸部リンパ節を選択しました。リンパ節腫脹は、典型的には、炎症反応を示し、したがって、そのようなノードは、生検のための理想的な候補です。 注：我々は、それが10mm 3未満の子宮頸部のノードの生検を行うことが非常に困難である発見しました。 シリンジホルダーに取り付けられた27 G、0.5インチの針で1mlシリンジを配置することによって、生検用の針と注射器を準備します。マウスの首（ 図4A）に針90°を配向させるためにニードルホルダを調整します。 針のレベルに全体のマウスのプラットフォームを上昇させることによって準備します。 3Dモーターを除去し、背の高いplatfに切り替えることでこれを達成しますORM、または提供される短いプラットフォームの下で適切な高さの立体物を配置することによって。この目的のためにプラスチック製のマイクロチューブのラックを使用してください。必要に応じて、針装置のネックと反対側に位置する生検ノードのためにプラットフォームを180°回転させます。 その後、「マックス＆拡張バッファ」を選択して、「環境設定」を選択することで取得設定を調整します。 8.00ミリメートルと9.73ミリメートルの幅の深さまで視野を拡大します。キーは、ダイヤル画面を使用して、針ガイドをオンにします。針ガイドは、画面上の針の経路を予測し、ユーザーが、生検のための正しい位置に関心のあるリンパ節をラインアップすることができます。 リンパ節は、途中でまたはわずか画面（ 図4B）の中央の左側にリンパ節を中心にして、ビューに常に残っていることを確認してください。手順の全体のシネループを得るためには、生検を開始する前に、システムのキーボード上のプリトリガーを押します。 針の先端は、ビューと皮膚に接触（ 図4B）になるまで、ニードルホルダを調整します。高速皮膚を穿刺するためにプッシュする、しっかりと針を進めます。チップはまた、（ 図4C）カプセルを穿刺し、髄質（ 図4D）内に表示されるまで針を前進させるために続けています。 針が適切にノード内に配置された後、静かに生検（ 図4Dおよび4E）を行うために戻って200〜300μlの境界設定との間にシリンジプランジャを引きます。生検材料は、シリンジ内に一般的に表示されていないことに注意してください。 静かにマウス首から針を取り除きます。 1.5mlマイクロチューブに注射器の内容物を排出します。チューブに針を残して、注射器から針を外します。同じ注射器で（一定分量から、株式の供給源から分離）の生検培地1mlを採取し、目に針を維持しながら、シリンジに針を再接続電子管。 チューブに生検メディアを排出することにより、生検メディアと注射器と針をすすぎます。 注：針が生検後の任意の時点で接続されている間、プランジャーを後方に引いてはいけません。これは、小さいサンプルサイズに生検材料を失う危険性を減少させます。 組織学的手段（ 図4F）によるリンパ節の内容を確認し、必要に応じて追加の方法（組織化学など 、フローサイトメトリー）によって分析します。 生検が完了すると、麻酔をオフにして、直腸温度プローブを削除します。ガーゼでマウスから過剰な超音波ゲルを外し、各足からテープを削除します。 イメージングプラットフォームからマウスを外し、ケージに戻します。生検部位からの最小限の出血が発生する可能性がありますが、これは介入せずに停止します。フル活動が再開されるまで回復中に、マウスを監視します。 4.イメージ子宮頸部リンパ節の分析<li>は、超音波ソフトウェアでは、分析のための画像を選択し、「画像処理」タブに移動します。 「3Dにロード」を選択します。 「1つのペインを表示」ボタンをクリックし、左上隅にある「3D再構成画像」を選択します。必要に応じて、画像を拡大するズーム機能を使用してください。ビューからのパワードップラーオーバーレイを削除するだけで、Bモードで画像を表示するには、「表示レイアウト」、トグル。これは、簡単に、その後の3-D分析中のリンパ節のエッジを参照することができます。リンパ節の始まりを見つけるために画像シリーズをスクロールします。 リンパ節に外接するには、「3D設定」タブに移動します。その後、「スタート」ボタンの横に「パラレル」の「ボリューム」を選択します。 スクロールして、個々の画像内の関心領域の周りに輪郭を描きます。全体のリンパ節を包含した画像がマークされるまで続けます。に「完了」を選択してください分析を完了。 画像の下部には、3Dボリュームおよび％血管分布が自動的に表示されます。 注：3Dボリュームは、リンパ節の容積に対応し、パーセント血管パワードップラーによる血流について陽性リンパ節の割合を表します。 「表示レイアウト」トグルB-モード画像上のオーバーレイとしてのパワードップラー画像を表示します。表面図に関心のあるボリューム領域のネットビューを観察します。さらなる使用のための映画（.AVI）としてタグ付けされた画像ファイル（TIF）形式または3Dスキャンで画像をエクスポートします。