Ad alta frequenza di Ecografia del mouse cervicali Linfonodi
Summary
Questo protocollo descrive l'applicazione di ultrasuoni ad alta frequenza (HFUS) per l'imaging di topo linfonodi cervicali. Questa tecnica consente di ottimizzare la visualizzazione e la quantificazione di cervicale morfologia linfonodi, il volume e il flusso di sangue. Immagine-guidate biopsia dei linfonodi cervicali e lavorazione di tessuto linfatico per la valutazione istologica è anche dimostrato.
Abstract
Ad alta frequenza ultrasuoni (HFUS) è ampiamente utilizzato come un metodo non invasivo per l'imaging strutture anatomiche interne in piccoli impianti sperimentali animali. HFUS ha la capacità di rilevare strutture piccoli come 30 micron, una proprietà che è stata utilizzata per la visualizzazione linfonodi superficiali nei roditori di luminosità (B) -mode. La combinazione di power Doppler con immagini B-mode consente di misurare circolatorio flusso di sangue all'interno dei linfonodi e altri organi. Mentre HFUS è stata utilizzata per l'imaging linfonodo in un certo numero di sistemi modello del mouse, non è stato riportato un protocollo dettagliato descrive HFUS imaging e caratterizzazione dei linfonodi cervicali in topi. Qui mostriamo che HFUS può essere adattato per rilevare e caratterizzare linfonodi cervicali in topi. Combinato B-mode e di imaging power Doppler può essere utilizzato per rilevare gli aumenti del flusso sanguigno in linfonodi cervicali immunologicamente allargata. Descriviamo anche l'uso di immagini B-mode per condurre fini biopsie di linfonodi cervicali senzades recuperare tessuto linfatico per l'analisi istologica. Infine, a pochi passi di software assistita sono descritte per calcolare variazioni di linfa di volume nodo e di visualizzare i cambiamenti in linfonodo morfologia seguenti ricostruzione delle immagini. La possibilità di monitorare visivamente cambiamenti nella cervice biologia linfonodi nel tempo fornisce una tecnica semplice e potente per il monitoraggio non invasivo della cervice alterazioni linfonodi in modelli preclinici murini di malattie del cavo orale.
Introduction
Linfodrenaggio del liquido tessuto interstiziale è il metodo principale di diffusione per i microrganismi infettivi e tumori derivanti nella regione orale e maxillo-facciale 1,2. La valutazione clinica dei linfonodi cervicali è una pratica comune utilizzata diagnostico per determinare la presenza o la progressione di malattie che hanno origine nella cavità orale. Ciò sottolinea l'importanza della raccolta linfonodi cervicali come preziosi siti anatomici per la diagnosi della malattia orale 3. Diverse metodologie di imaging specializzati sono clinicamente utilizzati per identificare malate linfonodi cervicali. Questi includono la tomografia a emissione di positroni (PET), la tomografia computerizzata (TC) e la risonanza magnetica (MR). Mentre grande valore, tutti questi metodi richiedono ampie preparazione del paziente, attrezzature altamente specializzate e / o infusione chimica nella circolazione per abilitare o migliorare il processo di imaging.
L'imaging ecografico (ultrasuoni, Stati Uniti) è una tecnica comunemente applicato utilizzata per imetà linfonodi cervicali presentano linfoadenopatia a causa di infezioni o metastasi 4-6. Stati Uniti è spesso combinato con PET-TC e RM per fornire una rappresentazione globale dello stato linfonodale paziente, contribuendo a determinare la stadiazione del tumore e la necessità di escissione chirurgica 7. La natura non invasiva degli Stati Uniti ha anche vantaggi intrinseci rispetto ad altre modalità di imaging, tra cui la facilità di utilizzo, a basso costo, il minimo disagio per il paziente e la preparazione. La posizione sottocutaneo superficiale della maggior parte dei linfonodi cervicali permette agli Stati Uniti a guidare mini-invasive fini biopsie ago aspirazione con maggiore precisione, migliorando l'accuratezza diagnostica 8.
Commercial-alta frequenza (HF) US fornisce una risoluzione dettagliata delle strutture anatomiche interne a 30 micron 9. Utilizzando trasduttori vanno 22-70 MHz, HFUS è facilmente applicata ad una varietà di sistemi di roditori sperimentali per permettere imaging in tempo reale degli organi interni in vivo.; HFUS è stato adattato per la visualizzazione della formazione di tumori in convenzionale luminosità (B) -MODE, nonché con un numero di generale e specializzata agents9 miglioramento del contrasto. Utilizzando power Doppler con HFUS fornisce la possibilità di monitorare il flusso di sangue all'interno dei tumori del mouse, consentendo una valutazione globale di perfusione angiogenico nei topi dal vivo 10,11. HFUS è stato usato per visualizzare malate nodi linfatici del mouse all'interno della cavità del corpo principale, dimostrando l'utilità parallelo di questa tecnologia per la pratica clinica. In particolare, infiammatorie e metastatici alterazioni linfonodi viscerale è stato osservato in modelli murini di cancro al seno nutrire 12,13, pancreatici 14, del colon-retto e del polmone 15 16 tumori, così come histocytomas fibrosi 17, e di un modello murino di età idronefrosi acquisito 18 . Questi esempi solidificare il valore di HFUS come un potente strumento di indagine per linfoadenopatia neoplastica in un'ampia varietà di rosistemi dent.
Diversi modelli di infezione batterica 19,20 e testa e del collo a cellule squamose (HNSCC) 21,22 sono stati sviluppati per studiare queste malattie in ambito preclinico. In contrasto con gli esseri umani, i topi contengono tre linfonodi cervicali che un'indagine della linfa dai tessuti orali cavità (mandibolare, mandibolare sottomandibolare e parotide superficiali 23). Recentemente, abbiamo riportato l'uso di HFUS per mappare la posizione e la morfologia di questi linfonodi, il monitoraggio dei cambiamenti nei linfonodi di volume nodo e il flusso di sangue in un modello murino cancerogena indotta HNSCC 24. Qui, mettiamo a disposizione un protocollo dettagliato per l'utilizzo di HFUS per l'identificazione, l'imaging e l'analisi dei linfonodi cervicali in topi vivi. Questo protocollo dimostra anche la possibilità di utilizzare HFUS condurre immagine- guidata ago sottile biopsia del mouse allargata linfonodi cervicali, consentendo il monitoraggio istologico di cambiamenti nel contenuto di linfonodi cervicali e patologie oltre tIme nello stesso animale. Questo protocollo è facilmente adattabile per consentire lo studio dettagliato delle patologie cervicali linfonodali risultanti da qualsiasi malattia invasiva cavità orale in topi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo descritto permette la visualizzazione e la valutazione in situ di murine linfonodi cervicali utilizzando non invasiva di imaging HFUS. L'uso di B-mode e potenza Doppler per visualizzare cervicale morfologia linfonodi, volume e linfonodo flusso sanguigno prevede una analisi sperimentale preclinici sistemi modello topo simile a quello utilizzato per la caratterizzazione dei nodi cervicali paziente nella pratica clinica. La possibilità di monitorare i linfonodi cervial tramite biopsia con ago sottile offre anche una tecnica utile per rilevare le alterazioni delle cellule immunitarie e la presenza di tipi cellulari stranieri o batteri durante cavità orale malattia indotta linfadenopatie nei topi. La facilità di utilizzo e basso costo associato con HFUS permette lo screening rapido di stato dei linfonodi cervicali in un'ampia varietà di modelli animali.
Un passo fondamentale in questo protocollo è l'identificazione successo iniziale dei linfonodi cervicali nelle immagini HFUS. La nostra struttura ha un assortimento di HFUS transducers come descritto, così li abbiamo utilizzati per ottenere immagini di altissima qualità. Tuttavia, se i trasduttori descriviamo non sono disponibili, è possibile adattare l'immagine che utilizzano altri trasduttori. A questo scopo, regolando la profondità e la larghezza dell'immagine per ottenere un'immagine adeguata è tutto ciò che è richiesto. Risoluzione di tali immagini può variare, ma dovrebbe essere ancora possibile ottenere immagini di alta qualità usando HFUS. Monumenti Imaging della cavità orale e la ghiandola tiroidea notevolmente aiuto nell'orientare l'utente alla regione appropriata in cui sono localizzati i linfonodi. La caratteristica, natura ipoecogena ovale e la posizione superficiale vicino alla superficie della pelle consente di identificazione rapida conferma dei linfonodi cervicali all'interno della regione corretta collo. Mentre tutti e tre i nodi possono essere visibili in un unico piano di imaging (figura 3B), tipicamente uno o due nodi vengono catturati durante l'imaging. Aggiustamenti minori del trasduttore di posizione possono essere condotte a squarciareer di imaging diversi piani visibile, consentendo la visualizzazione di tutti i nodi su un unico lato del collo.
Mentre abbiamo trovato la tecnica descritta affidabile per l'identificazione di linfonodi cervicali, ci sono limitazioni specifiche per la tecnica di imaging e biopsia. La natura superficiale del topo linfonodi cervicali conferisce mobilità eccessiva quando anche una leggera pressione viene applicata alla pelle attraverso la testa trasduttore. Questo può essere neutralizzata lentamente applicazione della testina trasduttore nel gel ultrasuoni sul collo mouse finché sono state identificate le immagini di riferimento. Mobilità linfonodale può anche complicare la biopsia con ago sottile, soprattutto quando si utilizza trasduttori nella risoluzione più alta (50 MHz) gamma. Immagini centrate di linfonodi per biopsia sono tipicamente spinti fuori dal campo visivo dovuto alla forza della biopsia necessario per perforare la pelle sovrastante e capsule. Questo può essere risolto dal posizionamento fuori centro del linfonodo verso la direzione di entrata dell'ago,fornire spazio per il linfonodo da spingere attraverso ma rimangono ancora all'interno del campo di visualizzazione durante biopsia. Nella nostra esperienza, i linfonodi> 10 mm 3 sono molto difficili da biopsia, e sono spesso spinti dalla ago piuttosto che penetrare durante ago avanzamento. Così, la biopsia andrebbe riservato ai linfonodi ingrossati in cui la dimensione è> 10 mm 3 per garantire una sufficiente dimensione di destinazione del nodo e la stabilità nella regione cervicale. Inoltre, materiale bioptico non può contenere il numero di cellule sufficiente per le procedure che richiedono il numero di cellule grandi (ad esempio, citometria a flusso).
HFUS è stato utilizzato con successo per visualizzare HNSCC ortotopica tumori 25, e ha il potenziale per controllare le metastasi nodo cervicale nei topi con tumori orali 24. Oltre a ultrasuoni, l'imaging bioluminescenza è stato utilizzato anche per visualizzare la formazione del tumore orale ortotopica e metastasi linfonodali cervicali in topi vivi 26,27. Come un Alternapproccio ative, imaging bioluminescenza ha un netto vantaggio rispetto HFUS di essere in grado di quantificare direttamente la progressione del tumore e l'onere metastatico nel tempo nello stesso animale. Mentre innegabilmente utile, l'imaging bioluminescenza è in grado di misurare molti dei parametri visualizzati da HFUS, inclusa la linfa morfologia nodo, volumi nodali o il flusso di sangue. L'imaging bioluminescenza richiede anche scatole scure specializzati per mantenere i topi durante l'imaging, rendendo questa tecnica non adatto per l'adattamento per biopsia con ago sottile.
Inoltre, l'imaging bioluminescenza richiede la produzione di cellule tumorali che esprimono stabilmente l'enzima luciferasi, permettendo a questa tecnica deve essere utilizzato solo in casi di xenotrapianti ortotopici con le cellule tumorali luciferasi transfettate in topi immunocompromessi, o con sistemi di transgenici tessuto-specifici inducibili che limitano l'espressione luciferasi in modo spazio-temporale specifico tessuto di origine tumorale. Al contrario, HFUS può essere used in combinazione con le immagini bioluminescenza in questi modelli, oltre ad essere in grado di immaginare linfonodi cervicali in modelli di tumori orali cancerogeno-indotta in topi con sistemi immunitari completi 28,29. Mentre HFUS può essere più adattabile alla maggior parte dei modelli murini di cancro orale, i dati combinata che può essere ottenuto da bioluminescenza e HFUS immagini in sistemi in cui le cellule tumorali esprimono luciferasi in grado di fornire un quadro più completo di coinvolgimento linfonodale cervicale rispetto sia di imaging modalità solo.
La capacità di identificare e rilevare topo linfonodi cervicali in tempo reale consente questa tecnica per essere utilizzato nella maggior parte dei modelli di malattia orale che provocano linfoadenopatia infiammatoria dove l'animale può essere mantenuto in posizione invertita in anestesia breve termine. Il rilevamento di metastasi ai linfonodi o infezioni batteriche e l'impatto sulla concomitante linfonodo morfologia in animali vivi presenta un vantaggio significativo rispetto ai metodi tradizionaliche richiedono i linfonodi per essere rimosso da animali morti per l'elaborazione istologica. Combinando HFUS con biopsia con ago sottile permette un mezzo per condurre l'analisi patologica di routine dei linfonodi cervicali, simile a quello che viene condotto in clinica, che fornisce un metodo migliore per monitorare la progressione della malattia nella maggior parte dei modelli attuali murini di patologie del cavo orale.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal fondo Dorothy D. Radford Endowment dalla West Virginia University Maria Babb Randolph Cancer Center. L'uso della West Virginia University animale Modelli e Imaging Facility (AMIF) e Microscopia Imaging Facility (MIF) (supportato dalla Maria Babb Randolph Cancer Center e NIH sovvenzioni P20 RR16440, P30 RR032138 / GM103488 e S10 RR026378) si ringraziano.
Materials
| Vevo2100 High Resolution Micro-ultrasound Imaging System, with integrated software Version 1.6.0 | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | VS-11945 | |
| Power Dopper Mode and 3D Mode | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | VS-11952; VS-11484 | |
| Vevo compact anesthesia system | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | ||
| Vevo integrated rail system including 3D motor and micromanipulator for injections | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | SA-11983 | |
| Thermasonic Gel Warmer | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | Optional | |
| Transducers – MS-550D (Broadband frequency: 22 MHz – 55 MHz) | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | VS-11960 | Referred to as 40 MHz Transducer |
| Transducers – MS-700 (Broadband frequency: 30 MHz – 70 MHz) | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | VS-12026 | Referred to as 50 MHz Transducer |
| Ophthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 07-888-1663 | |
| Electrode gel | Parker Laboratories | 174-1525 | |
| Tape | Medical Arts Press | 174-153000 | |
| Depilatory Cream | Carter Products | ||
| Cotton swabs | General Supply | ||
| Gauze | Fisher Scientific | 22-037-907 | |
| Water | General Supply | ||
| Lubricating gel | Parker Laboratories | 57-05 | |
| Ultrasound gel | Parker Laboratories | 01-50 | |
| Microcentrifuge tube rack | General Supply | Used to raise mouse platform for optimal biopsy position | |
| 27G ½ inch needle with 1 ml syringe | Fisher Scientific | 14-826-87 | |
| ThinPrep PreservCyt Solution | Hologic | 70097-002 | Refered to as biopsy media |
| Microcentrifuge tubes | General Supply | ||
| Thinprep 2000 processor | Cytyc, Marlborough, MA | Blue Filter | |
| Olympus AX70 Provis Microscope | Olympus, Center Valley, PA |
Riferimenti
- Montone, K. T. Infectious diseases of the head and neck: a review. Am J Clin Pathol. 128 (1), 35-67 (2007).
- Bryson, T. C., Shah, G. V., Srinivasan, A., Mukherji, S. K. Cervical lymph node evaluation and diagnosis. Otolaryngol Clin North Am. 45 (6), 1363-1383 (2012).
- Joshi, P. S., Pol, J., Sudesh, A. S. Ultrasonography – A diagnostic modality for oral and maxillofacial diseases. Contemp Clin Dent. 5 (3), 345-351 (2014).
- Oz, F., et al. Evaluation of clinical and sonographic features in 55 children with tularemia. Vector Borne Zoonotic Dis. 14 (8), 571-575 (2014).
- Niedzielska, G., Kotowski, M., Niedzielski, A., Dybiec, E., Wieczorek, P. Cervical lymphadenopathy in children–incidence and diagnostic management. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 71 (1), 51-56 (2007).
- Ying, M., Bhatia, K. S., Lee, Y. P., Yuen, H. Y., Ahuja, A. T. Review of ultrasonography of malignant neck nodes: greyscale, Doppler, contrast enhancement and elastography. Cancer Imaging. 13 (4), 658-669 (2013).
- Stoeckli, S. J., et al. Initial staging of the neck in head and neck squamous cell carcinoma: a comparison of CT, PET/CT, and ultrasound-guided fine-needle aspiration cytology. Head Neck. 34 (4), 469-476 (2012).
- Rottey, S., et al. Evaluation of metastatic lymph nodes in head and neck cancer: a comparative study between palpation, ultrasonography, ultrasound-guided fine needle aspiration cytology and computed tomography. Acta Clin Belg. 61 (5), 236-241 (2006).
- Greco, A., et al. Ultrasound biomicroscopy in small animal research: applications in molecular and preclinical imaging. J Biomed Biotechnol. 2012, (2012).
- Chen, J. J., Fu, S. Y., Chiang, C. S., Hong, J. H., Yeh, C. K. Characterization of tumor vasculature distributions in central and peripheral regions based on Doppler ultrasound. Med Phys. 39 (12), 7490-7498 (2012).
- El Kaffas, A., Giles, A., Czarnota, G. J. Dose-dependent response of tumor vasculature to radiation therapy in combination with Sunitinib depicted by three- dimensional high-frequency power Doppler ultrasound. Angiogenesis. 16 (2), 443-454 (2013).
- Bachawal, V. S. Earlier detection of breast cancer with ultrasound molecular imaging in a transgenic mouse model. Cancer Res. 73 (6), 1689-1698 (2013).
- Loveless, M. E., et al. A method for assessing the microvasculature in a murine tumor model using contrast-enhanced ultrasonography. J Ultrasound Med. 27, 12-1699 (2008).
- Snyder, C. S., et al. Complementarity of ultrasound and fluorescence imaging in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer. BMC Cancer. 9, 106 (2009).
- Kodama, T., et al. Volumetric and angiogenic evaluation of antitumor effects with acoustic liposome and high-frequency ultrasound. Cancer Res. 71 (22), 6957-6964 (2011).
- Hwang, M., Hariri, G., Lyshchik, A., Hallahan, D. E., Fleischer, A. C. Correlation of quantified contrast-enhanced sonography with in vivo tumor response. J Ultrasound Med. 29 (4), 597-607 (2010).
- Li, L., Mori, S., Sakamoto, M., Takahashi, S., Kodama, T. Mouse model of lymph node metastasis via afferent lymphatic vessels for development of imaging modalities. PLoS One. 8 (2), e55797 (2013).
- Springer, D. A., et al. Investigation and identification of etiologies involved in the development of acquired hydronephrosis in aged laboratory mice with the use of high-frequency ultrasound imaging. Pathobiol Aging Age Relat Dis. 4, (2014).
- Papadopoulos, G., et al. A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites. J Vis Exp. (90), (2014).
- Vulcano, A. B., et al. Oral infection with enteropathogenic Escherichia coli triggers immune response and intestinal histological alterations in mice selected for their minimal acute inflammatory responses. Microbiol Immunol. 58 (6), 352-359 (2014).
- Myers, J. N., Holsinger, F. C., Jasser, S. A., Bekele, B. N., Fidler, I. J. An orthotopic nude mouse model of oral tongue squamous cell carcinoma. Clin Cancer Res. 8 (1), 293-298 (2002).
- Kanojia, D., Vaidya, M. M. 4-nitroquinoline-1-oxide induced experimental oral carcinogenesis. Oral Oncol. 42 (7), 655-667 (2006).
- Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. J Immunol Methods. 312 (1-2), 12-29 (2006).
- Walk, E. L., McLaughlin, S., Coad, J., Weed, S. A. Use of high frequency ultrasound to monitor cervical lymph node alterations in mice. PLoS One. 9 (6), e100185 (2014).
- Pezold, J. C., Zinn, K., Talbert, M. A., Desmond, R., Rosenthal, E. L. Validation of ultrasonography to evaluate murine orthotopic oral cavity tumors. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 68 (3), 159-163 (2006).
- Sano, D., Myers, J. N. Metastasis of squamous cell carcinoma of the oral tongue. Cancer Metastasis Rev. 26 (3-4), 645-662 (2007).
- Sano, D., et al. The effect of combination anti-endothelial growth factor receptor and anti-vascular endothelial growth factor receptor 2 targeted therapy on lymph node metastasis: a study in an orthotopic nude mouse model of squamous cell carcinoma of the oral tongue. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 135 (4), 411-420 (2009).
- Tang, X. H., Knudsen, B., Bemis, D., Tickoo, S., Gudas, L. J. Oral cavity and esophageal carcinogenesis modeled in carcinogen-treated mice. Clin Cancer Res. 10 (1 Pt 1), 301-313 (2004).
- Vitale-Cross, L., et al. Chemical carcinogenesis models for evaluating molecular- targeted prevention and treatment of oral cancer. Cancer Prev Res (Phila). 2, 419-422 (2009).
