A medição por HPLC do ADN Oxidação de biomarcador, 8-oxo-7,8-di-hidro-2'-desoxiguanosina, e em células em cultura de tecidos animais
Summary
O objectivo do presente protocolo é a detecção do marcador de oxidação do DNA, 8-oxo-7,8-di-hidro-2'-desoxiguanosina (8-oxo-dGuo) por CLER-ED, no DNA a partir de células cultivadas ou tecidos animais.
Abstract
O stress oxidativo está associado a diversos processos fisiológicos e patológicos, assim como o metabolismo xenobiótico, levando a oxidação de biomacromoléculas, incluindo ADN. Portanto, a detecção eficiente de oxidação do DNA é importante para uma variedade de disciplinas de investigação, incluindo a medicina e toxicologia. Um biomarcador comum de ADN é danificado oxidativamente 8-oxo-7,8-di-hidro-2'-desoxiguanosina (8-oxo-dGuo; erroneamente frequentemente referido como 8-hidroxi-2'-desoxiguanosina (8-OH-dGuo ou 8 -oxo-dG)). Vários protocolos de medição 8-oxo-dGuo por cromatografia líquida de alta pressão com detecção electroquímica (HPLC-ED) foram descritos. No entanto, estas foram principalmente aplicada a ADN purificado tratados com pró-oxidantes. Além disso, devido a diferenças metodológicas entre laboratórios, principalmente devido às diferenças de equipamento analítico, a adoção de métodos publicados para a detecção de 8-oxo-dGuo por HPLC-ED requer otimização cuidadosa de cada laboratório. UMAprotocolo abrangente, que descreve este processo de otimização, é inexistente. Aqui, um protocolo detalhado é descrito para a detecção de 8-oxo-dGuo por CLER-ED, no DNA a partir de células cultivadas ou tecidos animais. Ele ilustra como a preparação da amostra de ADN podem ser facilmente e rapidamente optimizada para minimizar a oxidação do ADN indesejáveis que podem ocorrer durante a preparação da amostra. Este protocolo demonstra como detectar 8-oxo-dGuo em células humanas cultivadas adenocarcinoma alveolar (isto é, células A549) tratadas com o agente oxidante KBrO 3, e a partir do baço de ratinhos expostos ao hidrocarboneto aromático policíclico dibenzo (DEF, p) criseno (DBC, anteriormente conhecido como dibenzo (a, l) pireno, DalP). Em geral, este trabalho ilustra como uma metodologia de CLER-ED pode ser facilmente optimizado para a detecção de 8-oxo-dGuo em amostras biológicas.
Introduction
Espécies reativas de oxigênio (ROS), cujos níveis de estado estacionário pode aumentar durante muitas condições patológicas e metabolismo xenotoxic, contribuir para um aumento da frequência de dano oxidativo ao DNA. Entre os vários possíveis nucleobases produtos de oxidação, lesões oxidativas do ADN pode ser facilmente medida utilizando o marcador estável de 8-oxo-7,8-di-hidro-2'-desoxiguanosina (8-oxo-dGuo), que é uma das formas oxidadas de 2 ' -deoxyguanosine (dGuo) 1. 8-oxo-dGuo é o mais abundante lesão de DNA 2 e, por conseguinte, foi estudada a maior detalhe como um biomarcador oxidação DNA, apesar da existência de múltiplos produtos de oxidação de ADN 3. Nos seres humanos, este dano pode ser reparado através de base de reparo de excisão por 8-oxoguanine glicosilase 1 (hOGG1) 4. Se reparado, 8-oxo-dGuo pode contribuir para a formação da base de mutações de substituição de par (isto é, transversões de G para T) 4. Importante, 8-oxo-dGuo é um marcador estabelecido fodano do ADN r em relação à iniciação e promoção da carcinogénese 2. Portanto, a quantificação precisa de 8-oxo-dGuo é um biomarcador útil e desejável de dano oxidativo ADN 5.
Há uma confusão generalizada na literatura sobre os nomes corretos para as formas oxidativamente-danificadas do 2-desoxiguanosina e, além disso, o nome correto do composto (s) medidos rotineiramente como um biomarcador de dano oxidativo DNA 6. Os 6,8-diceto-enol e 6, 8-ceto formas tautoméricas de 8-oxo-dGuo (mostrado na Figura 1) são os dois tautómeros mais proeminentes discutidos na literatura 5,7. A forma de ácido 6,8-diceto é a forma mais proeminente a pH fisiológico de 7,4, e é o mais proeminente do produto de oxidação de DNA 7. Portanto, 8-oxo-dGuo, em vez de 8-hidroxi-dGuo é o nome mais adequado para este produto de oxidação 6. É também importante notar que a 2-desoxiguanosina (dGuo), em vez de nucleobase guanina (Gua) ou guanosina ribonucleósido (Guo), respectivamente, é detectado pela maioria dos métodos 6.
Detecção e quantificação de 8-oxo-dGuo preciso é um desafio devido a: i) a variabilidade na digestão da amostra de ADN, ii) oxidação acidental de dGuo a 8-oxo-dGuo que pode ocorrer durante a preparação da amostra, e iii) a necessidade eficaz para validação do método de HPLC analítico ED-8. Neste protocolo, com vista à consecução i) proporcionando condições favoráveis, para a digestão completa do ADN e ii) pela inclusão quelante de metal e soluções tratados com quelantes e um reagente especial de isolamento de DNA, enquanto iii) foi apenas parcialmente abordados pela inclusão de controlos positivos e proporcionando, assim, que o método é capaz de detectar 8-oxo-dGuo em amostras biológicas. Além disso validação está além do escopo deste artigo. No entanto, estamos confiantes de que este protocolo vai ajudar o prospectivoutilizadores determinar a extensão em que eles precisam validar formalmente o protocolo, dependendo das suas finalidades. Uma lista dos passos requeridos para a validação formal do método é ainda proporcionado. Durante o desenvolvimento e implantação de um método de detecção 8-oxo-dGuo, métodos publicados foram revistos e consolidados. Assim, este método elimina a necessidade de recolher informações a partir de várias fontes publicadas que carecem frequentemente importantes detalhes experimentais ao mesmo tempo proporcionar meios rápidos e simples de testar se o método para a detecção e quantificação de 8-oxo-dGuo foi adoptada com sucesso. Este método foi adaptado empregue com sucesso para analisar amostras de ADN a partir de células cultivadas e tecidos de murino. Este artigo de vídeo ajudará outros grupos no estabelecimento de um método eficaz para a detecção e quantificação fiável de 8-oxo-dGuo por CLER-ED.
Protocol
Representative Results
Discussion
Apesar de 8-oxo-dGuo foi classificado como um biomarcador útil de oxidação do DNA, a sua quantificação confiável pode representar um desafio. Embora existam vários métodos publicados, há uma necessidade de uma visão abrangente, descritivo de protocolo para permitir que pesquisadores para implantar o método em seus laboratórios. Aqui apresentamos uma visão detalhada de um protocolo baseado em HPLC que irá permitir novos usuários para estabelecer um método eficaz para a detecção e quantificação de 8-ox…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi financiada pelo Canadá Health Initiative Genomics Research e Desenvolvimento (GRDI) ea Estratégia Regulatória Canadense de Biotecnologia (RCSB). Os autores não têm qualquer conflito de interesses.
Materials
| 8-oxo-dGuo standard | Cayman Chemical Company | 89320 | Inappropriately referred to as "8-hydroxy-2'-deoxy Guanosine" – see Fig. 1 and text for details |
| Alkaline phosphatase | Sigma-Aldrich | P5931 | From E.coli |
| Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | Chelates heavy metals |
| Desferoxamine mesylate | Sigma-Aldrich | D9533 | |
| dGuo standard | Sigma-Aldrich | D7145 | |
| Dibasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| DNA from salmon sperm | Sigma-Aldrich | D1626 | Sodium salt |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4527 | TypeII, from bovine pancreas |
| DNAzol | Invitrogen | 10503-27 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E4884 | The compound would not completely dissolve until solution pH is adjusted to 8.0 with e.g. NaOH |
| F12-K media | ATCC | 30-2004 | |
| Foetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | |
| Guard column | Chromatographic Specialties | YBA 99S03 0204GC | Protects colum from contamination; may also lead to pressure build-up |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Monobasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline | Invitrogen | 15190-250 | |
| Phosphodiesterase I enzyme | Sigma-Aldrich | P3243 | Type II from Crotalus adamaneus venom |
| Teflon homogenizer | Thomas Scientific | 7724T-1 or 7724T-5 for 1 or 5 mL, respectively | Volume (holding capacity) depends on the amount of sample to be processed. |
| Trypsin | Invitrogen | 15050-065 | |
| YMC-BASIC column with bonded spherical silica | Chromatographic Specialties | YBA 99S03 1546WT |
Riferimenti
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