מדידה המרבית איזומטרי הכוח שנוצרה על ידי סיבי שריר שלד permeabilized
Summary
ניתוח של מאפייני ההתכווצות של סיבי שריר כימי עור, או permeabilized, שלד מציע אמצעי רב עוצמה שבאמצעותו להעריך את תפקוד שרירים ברמה של תא השריר הבודד. במאמר זה אנו מתארים טכניקה תקפה ומהימנה להכנה ובדיקת permeabilized סיבי שריר שלד במבחנה.
Abstract
Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. Single muscle fiber studies are useful in both basic science and clinical studies. For basic studies, single muscle fiber contractility measurements allow investigation of fundamental mechanisms of force production, and analysis of muscle function in the context of genetic manipulations. Clinically, single muscle fiber studies provide useful insight into the impact of injury and disease on muscle function, and may be used to guide the understanding of muscular pathologies. In this video article we outline the steps required to prepare and isolate an individual skeletal muscle fiber segment, attach it to force-measuring apparatus, activate it to produce maximum isometric force, and estimate its cross-sectional area for the purpose of normalizing the force produced.
Introduction
התפקיד העיקרי של שרירי שלד הוא ליצור כוח. כוח השריר שהושרו בvivo דרך רצף אירועים מורכב הכולל פוטנציאלי עצב מוטורי פעולה, העברת עצבית-שרירית, פוטנציאל פעולת סיב שריר, שחרור של סידן תוך תאי, והפעלה של המערכת של חלבונים רגולטוריים והתכווצות. בגלל דור כוח הוא התוצאה הסופית של רצף זה, גירעון בכוח יכול להיגרם על ידי כישלון של אחד או יותר מהצעדים הבודדים. תכונת מפתח של הכנת סיבי permeabilized היא שזה מבטל את רוב הצעדים הנדרשים לדור כוח in vivo, עם רק את הפונקציות רגולטוריות והתכווצות הקשורים למנגנון myofibrillar שנותר. החוקר מניח את שליטה על האספקה של הפעלת סידן ואנרגיה (ATP), וזוכה למערכת פשוטה המאפשרת הערכה של המבנים רגולטוריים והתכווצות המבודדים בשיתוף מולדתםnfiguration. מדידות של כוח באמצעות סיבי שריר שלד permeabilized הן כך יקרות כאשר להערכת שינויים בתפקוד שרירים נצפה in vivo. לדוגמא, השתמשנו בטכניקה זו כדי לאפיין את יכולת כוח יצירת של סיבים מעכברים חסרי מיוסטטין 1 ולהעריך את הגורם לחולשת שרירים מתמשך הציגה הבא דמעות שרוול מסובב כרוני 2,3.
המתודולוגיה סיבי permeabilized מודרנית ניתן לייחס ללימודי השפעה מוקדמים 4,5 ונמצאת כעת בשימוש על ידי מספר קבוצות מחקר. למרות הטכניקות תוארו בספרות, הם עדיין לא הוצגו בפורמט וידאו. מטרתו של מאמר זה היא להמחיש טכניקה מעודכנת, תקפה ומהימנה למדידת קיבולת כוח להפקת המקסימום של סיבים בודדים מדגימות שריר שלד permeabilized כימית. כדי להשיג זאת, קטע סיבים בודד (ייקרא להלן ̶0; סיבים ") מופק מחבילה-permeabilized מראש של סיבים והניחו בתא ניסוי המכיל פתרון מרגיע, התכונה המגדירה של אשר היא ריכוז סידן שהם <10 ננומטר. הסיבים מחוברים אז בקצה אחד לכוח-רגשי ובקצה השני לאורך-בקר. עם הסיבים שנערכו באורך sarcomere אופטימלי, הוא מועבר לפתרון המפעיל שיש ריכוז סידן מספיק כדי לעורר הפעלה המרבית וכוח כיווץ איזומטרי כך מרבי. נתוני כוח נרכשים, מאוחסנים ונותחו באמצעות מחשב אישי.
Protocol
Representative Results
Discussion
הערכות של תכונות התכווצות של סיבי שריר שלד יחידים permeabilized משמשות לחקור את תפקוד שרירים במגוון רחב של הקשרים. דוגמאות כוללות מחקרים שהעריכו את ההשפעות של הזדקנות 12, לממש 10,13,14, טיסה לחלל 15, פציעה 2,3,16, טיפולים תרופתיים 17,18, 19 ומחל מניפולציה גנטית 20,21 במבנה סיבים ותפקוד. בשל היכולת להעריך ישירות את ביצועי ההתכווצות של myofibrils בתצורה המקורית שלהם, טכניקה זו מספקת פלטפורמה אטרקטיבית שממנו ניתן ליצור הבנה נעדרה פונקצית myofibrillar של השפעות שעלולים להיות מבלבלות שנמצאות כאשר אות שידור עצבית-שרירית ושחרור סידן מושרה עירור כלולים במערכת הנחקרת. יתר על כן, בדיקות פונקציונליות של סיבים יחידים יכולות לשמש כדי להשלים את תוצאות זיהוי חלבון התכווצות כגון אלהשהושג באמצעות אימונוהיסטוכימיה או ג'ל אלקטרופורזה + מערבי כתם 22.
אחד מתפקידיו העיקריים של שרירי שלד הוא ליצור כוח. כתוצאה מכך o SF, מדד ליכולת כוח יצירת הפנימית של מערכת התכווצות, הוא עניין רב לפיזיולוגים שריר. אומדנים מהימנים של o SF דורשים אמצעים מדויקים של שני CSA הסיבים וo F. מאז סיבים הם, באופן כללי, לא עגול בחתך, ולא אחיד בCSA לאורך שלהם, יש לנקוט זהירות רבה באמידת CSA. לשם כך, מדידות נעשות בכמה מקומות לאורך הסיבים ו, בכל מקום, משתי נקודות מבט מופרדים על ידי 90 מעלות. אמצעים אמין של o F דורשים תשומת לב לכמה פרטים כוללים היווה כוח פסיבי, התאמת אורך sarcomere למקסם חפיפה של חוטים עבים ודקים, המעסיק פתרון המפעיל עם T ריכוז סידןתוצאות כובע בהפעלה מקסימלי, שמירה על טמפרטורת הניסוי הרצויה, ושמירה על תנאים אופטימליים לאחסון (טמפרטורה ומשך זמן) של הסיבים לפני היום של הניסוי.
בעוד השלבים המתוארים כאן מתארים את ההליך להערכת כוח איזומטרי מרבי, הוא לעתים קרובות רצוי להעריך איכויות פונקציונליות חשובות אחרות של סיבי שריר שלד. זו יכולה להיות מושגת על ידי הרחבת פרוטוקול הניסוי לכולל מניפולציות מכאניות נוספות של הסיבים. לדוגמא, מדידה של המהירות שבה הסיבים מקצר נגד שורה של עומסים שונים מאפשרת קביעת יחסי כוח-מהירות, שממנו ניתן לחשב יחסי כוח-כוח ומהירות-כוח 10,23,24. בנוסף, המהירות של קיצור טעון יכולה להיקבע על ידי המעסיק את "המבחן הרפוי" 25, אשר מורכבים של יישום שורה של צעדי קיצור ישכנע רפויים וmeasuring הזמן הנדרש על ידי הסיבים כדי להסיר את החסר. עוד פרמטר הקינטית שלעתים קרובות הוא דיווח k TR, שיעור קבוע לכוח שיפוץ הבא ההפרעות מכאניות שאופן זמני מתנתקת כל crossbridges 26. לבסוף, את הקשר בין ריכוז סידן ודור כוח פעיל ("יחסי הכוח-PCA") הוא לעתים קרובות עניין 18 ויכול להיקבע על ידי חשיפת הסיבים לסדרה של פתרונות עם ריכוזי סידן נעים בין מתחת לסף להפעלת ההתכווצות מערכת מספקת אלה כדי לעורר הפעלה מקסימלי ולכן כוח מרבי (o F).
למרות שהחלק גדול מהציוד שהוזכר יש צורך להערכת התכווצות סיב בודד, ציוד אחר הוא לא הכרחי. האורך-בקר, לדוגמא, הוא חיוני לכל פרוטוקול ניסוי שדורש הארכה או קיצור מהירים או מדויקת של הסיבים,אבל לא הכרחי להערכת כוח איזומטרי מרבי (אם כי ברמת אפס-כוח בשיא הכוח עדיין חייבת להיות מזוהה על ידי כמה אמצעים). המנסרות המאפשרות תצפית של הסיבים מהצד, בזמן ששימושי להערכת שטח חתך, אינן הכרחיים כאשר מיצוב הסיבים בתוך תא הניסוי. יתר על כן, אמצעים חלופיים לחשיפת הסיבים לפתרונות הניסיוניים השונים יכול להיות מועסקים, כולל תכנון מערכת-הפעלה ידנית של תאים או תא בודד שמאפשר למילוי מהיר וריקון של פתרונות. לבסוף, בעוד טמפרטורות ניסיוניות תת-פיסיולוגיות כמו 15 מעלות צלזיוס משמשות בדרך כלל כדי לשפר את שחזור של מדידות מכאניות 1,2,3,5,8,12,17,27, ניתן להפיק נתונים תקפים בטמפרטורות אחרות 23 , 28, כל עוד את ההשפעות של טמפרטורה על תכונות פתרון (ריכוז סידן, pH, וכו ') נלקחים בחשבון. </p>
היצירות של פתרונות הבדיקה הן בין ההיבטים הקריטיים ביותר של טכניקות סיבי permeabilized המתוארות כאן. שיקולים לגבי הרכב פתרון הם מורכבים ומעבר להיקף של מאמר זה. הפתרונות מתוארים בשלב 5 של סעיף הפרוטוקול נועדו עם דגש על הפעלה מהירה של סיבי permeabilized עם העברתה מקדם-הפעלה להפעלת פתרונות תוך שמירה על כוח קבוע יוני, הרכב קטיוני, וosmolarity 6,29. גישות אחרות להרכב פתרון כבר מועסקות בהצלחה ראויה לציון על ידי קבוצות מחקר אחרות, ובדרך כלל עושות שימוש בקבועים מחייבים שפורסמו וכלים חישוביים 27,30,31. הריכוזים של יוני סידן בפתרונות המפעיל השונים חשוב במיוחד במחקרים שכלל הפעלת submaximal כגון הערכות הכוח-PCA. בניסויים שבי סיבים מופעלים באופן מלא, כמו אלה שתארוד כאן, ריכוז סידן בפתרון המפעיל בדרך כלל עולה בהפרש נוח שנדרש כדי להשיג את הכוח מקסימאלי, מה שהופך את הידע המדויק שלה פחות קריטי. תוספת של קריאטין פוספט היא חשובה לחציצת תנודות ATP וADP intramyofibrillar שאחרת היה קשורות לפעילות התכווצות. קריאטין קינאז נדרש לזרז את העברת פוספט מקריאטין פוספט לADP. תחת תנאי ניסוי שמובילים לשיעורים גבוהים ATP מחזור, כוללים עבודה בטמפרטורות גבוהות או מדידת קיצור במהירות גבוהה בסיבים מהירים 32, קריאטין קינאז יש להוסיף לפתרון להשלים קריאטין קינאז אנדוגני שנשאר קשור לסיבים. לתנאי ניסוי פחות תובעניים, מערכת התחדשות ATP היא פחות קריטית 27.
מגבלות של טכניקת הסיב בודדת permeabilized כוללות את הבאים. נתונים שנוצרו על ידי בדיקות אלה מגדיריםתכונות התכווצות של יחידת myofibrillar הספציפית שצורפה למכשיר הניסיוני. כתוצאה מכך, זה לוכד רק חלק קטן של סיבי multinucleated כל שממנו הקטע הושג ש, בתורו, מייצג חלק קטן מהמספר הכולל של סיבים בתוך השריר. חוקרים צריכים לשקול בזהירות ובכך הדגימה הדרושה כדי לתמוך בכל מסקנות מהניסויים. בנוסף, בוחן את ההשפעה של התערבות אימון גופני על תפקוד סיבים מניח כי הסיבים העריכו גויסו אכן במהלך האימון. למרות שהפרוטוקול מנסה לחקות את הסביבה תאית הטבעית של הסיבים, תהליך permeabilization sarcolemma הוא לא ספציפי ובהכרח מאפשר מרכיבים תאיים מסיסים לנטרל באופן חופשי לפתרוני הרחצה. תוצאה נוספת של חדירות הקרום היא שינוי במאזן האוסמוטי שמעיד נפיחות בסיבים נפח 33.נפיחות סיבים מגדילה את המרחק בין סיבי אקטין ומיוזין וכתוצאה מכך רגישות מופחתת של סידן במערכת myofilament 34,35, אבל יכולות להיות הפוכה על ידי ההקדמה של תרכובות גדולות, אוסמוטי פעילה 34. הגבלה סופית לשקול היא התוצאה של הטכניקה המשמשת לחיבור סיבים למנגנון הניסיוני. זה תמיד דורש לעוות את הקשר המרחבי בתוך מערכת נימה ובסמוך לנקודות המצורף, עם השתתפות גירעונות תפקודיים. באופן ספציפי, האזורים של הסיבים ובסמוכים לנקודות החיבור באופן פונקציונלי בסכנה ובכך לתרום גמישות סדרת artifactual למערכת המדידה.
לסיכום, יש לנו תארנו אמצעי שבעזרתו להעריך את יכולת כוח-יצירת של סיבי שריר שלד permeabilized כימית במבחנה. למרות ההתמקדות של מאמר זה הייתה על הערכת generatin כוח איזומטרי המרביקיבולת גרם של סיבי שריר שלד אדם, הגישה הניסויית יכולה להיות משונית והרחיבה כדי לקבוע מגוון רחב של פרמטרים ויחסים הקינטית במגוון מינים, יונקים או אחר.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the following funding sources: R01-AR063649, AG-020591, F31-AR035931.
Materials
| Polystyrene culture test tube with cap | Fisher Scientific | 14-956-3D | |
| 0.5 mL screw cap micocentrifuge | Fisher Scientific | 02-681-334 | |
| 0.5 mL microcentrifuge caps with o-ring | Fisher Scientific | 02-681-358 | |
| Microcentrifuge cryobox | Fisher Scientific | 5055-5005 | |
| pH meter | Mettler-Toledo | FE20 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-11YZ | |
| Nonsterile-suture 10-0 monofilament | Ashaway Line Twine | S30002 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Forceps – Dumont #5 | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Microdissecting scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Stereo microscope | Leica Microsystems | MZ8 | |
| Micrometer drives | Parker Hannifin | 3936M | |
| Thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
| Water bath circulator | Neslab Instruments | RTE-111 | |
| Temperature controller | Aplha Omega Instruments | Series 800 | |
| LabVIEW software | National Instruments | – | |
| Computer | Varied | – | |
| Chamber system | Aurora Scientific | 802D | |
| Length-controller | Aurora Scientific | 312C | |
| Force-transducer | Aurora Scientific | 403A | |
| Reagents | |||
| K-proprionate | TCI America | P0510 | |
| Imadizole | Sigma-Aldrich | I0125 | |
| MgCl2•6H20 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Brij 58 | Sigma-Aldrich | P5884 | |
| EGTA (acid) | Sigma-Aldrich | E0396 | |
| Na2H2ATP•0.56H2O | Sigma-Aldrich | A7699 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 | |
| HEPES (acid) | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| MgO | Sigma-Aldrich | 529699 | |
| HDTA (acid) | TCI America | D2019 | |
| CaCO3 | Sigma-Aldrich | C4830 | |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| KOH (1N) | Sigma-Aldrich | 35113 | |
| HCL (1N) | Sigma-Aldrich | 318949 | |
| Na2CrP•4H2O | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| pH 10 standard | Fisher Scientific | SB115 | |
| pH 7 standard | Fisher Scientific | SB107 |
Riferimenti
- Mendias, C. L., Kayupov, E., Bradley, J. R., Brooks, S. V., Claflin, D. R. Decreased specific force and power production of muscle fibers from myostatin-deficient mice are associated with a suppression of protein degradation. J Appl Physiol. 111 (1), 185-191 (2011).
- Gumucio, J. P., Davis, M. E., Bradley, J. R., Stafford, P. L., Schiffman, C. J., Lynch, E. B., Claflin, D. R., Bedi, A., Mendias, C. L. Rotator cuff tear reduces muscle fiber specific force production and induces macrophage accumulation and autophagy. J Orthop Res. 30 (12), 1963-1970 (2012).
- Mendias, C. L., Roche, S. M., Harning, J. A., Davis, M. E., Lynch, E. B., Sibilsky Enselman, E. r., Jacobson, J. A., Claflin, D. R., Calve, S., Bedi, A. Reduced muscle fiber force production and disrupted myofibril architecture in patients with chronic rotator cuff tears. J Shoulder Elbow Surg. 1 (4), 111-119 (2015).
- Moss, R. L. Sarcomere length-tension relations of frog skinned muscle fibres during calcium activation at short lengths. J Physiol. 292, 177-192 (1979).
- Chase, P. B., Kushmerick, M. J. Effects of pH on contraction of rabbit fast and slow skeletal muscle fibers. Biophys J. 53, 935-946 (1988).
- Moisescu, D. G., Thieleczek, R. Calcium and strontium concentration changes within skinned muscle preparations following a change in the external bathing solution. J Physiol. 275, 241-262 (1978).
- Walker, S. M., Schrodt, G. R. I Segment lengths and thin filament periods in skeletal muscle fibers of the Rhesus monkey and the human. Anat Rec. 178, 63-81 (1974).
- Gollapudi, S. K., Lin, D. C. Experimental determination of sarcomere force-length relationship in type-1 human skeletal muscle fibers. J Biomech. 42, 2011-2016 (2009).
- Brenner, B. Technique for stabilizing the striation pattern in maximally calcium-activated skinned rabbit psoas fibers. Biophys J. 41 (1), 99-102 (1983).
- Claflin, D. R., et al. Effects of high and low-velocity resistance training on the contractile properties of skeletal muscle fibers from young and older humans. J Appl Physiol. 111, 1021-1030 (2011).
- Lynch, G. S., Faulkner, J. A., Brooks, S. V. Force deficits and breakage rates after single lengthening contractions of single fast fibers from unconditioned and conditioned muscles of young and old rats. Am J Physiol Cell Physiol. 295, C249-C256 (2008).
- Frontera, W. R., Rodriguez Zayas, A., Rodriguez, N. Aging of human muscle: understanding sarcopenia at the single muscle cell level. Phys Med Rehabil Clin N Am. 23, 201-207 (2012).
- Malisoux, L., Francaux, M., Theisen, D. What do single-fiber studies tell us about exercise training. Med Sci Sports Exerc. 39 (7), 1051-1060 (2007).
- Widrick, J. L., Stelzer, J. E., Shoepe, T. C., Garner, D. P. Functional properties of human muscle fibers after short-term resistance exercise training. Am J Physiol Regulatory Integrative Comp Physiol. 238, 408-416 (2002).
- Trappe, S. Effects of spaceflight, simulated spaceflight and countermeasures on single muscle fiber physiology. J Gravit Physiol. 9 (1), 323-326 (2002).
- Malisoux, L., Jamart, C., Delplace, K., Nielens, H., Francaux, M., Thiesen, D. Effect of long-term muscle paralysis on human single fiber mechanics. J Appl Physiol. 102, 340-449 (2006).
- Krivickas, L. S., Walsh, R., Amato, A. Single muscle fiber contractile properties in adults with muscular dystrophy treated with MYO-029. Muscle Nerve. 39, 3-9 (2009).
- Russell, A. J., et al. Activation of fast skeletal muscle troponin as a potential therapeutic approach for treating neuromuscular diseases. Nature Medicine. 18 (3), 352-356 (2012).
- Krivickas, L. S., Yang, J. I., Kim, S. K., Frontera, W. R. Skeletal muscle fiber function and rate of disease progression in amyotrophic lateral sclerosis. Muscle Nerve. 26, 636-643 (2002).
- Mendias, C. L., Marcin, J. E., Calerdon, D. R., Faulkner, J. A. Contractile properties of EDL and soleus muscles of myostatin-deficient mice. J Appl Physiol. 101, 898-905 (2006).
- Lynch, G. S., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Faulkner, J. A. Contraction-induced injury to single permeabilized muscle fibers from mdx, transgenic mdx and control mice. Am J Physiol Cell Physiol. 279, 1290-1294 (2000).
- Mizunoya, Q., Wakamatsu, J., Tatsumi, R., Ikeuchi, Y. Protocol for high-resolution separation of rodent myosin heavy chain isoforms in a mini-gel electrophoresis system. Anal Biochem. 377, 111-113 (2008).
- Hill, A. V. The heat of shortening and the dynamic constants of muscle. Proc R Soc Lond B Biol Sci. 126, 136-195 (1938).
- Bottinelli, R., Canepari, M., Pellegrino, M. A., Reggiani, C. Force-velocity properties of human skeletal muscle fibres: myosin heavy chain isoform and temperature dependence. J Physiol. 495, 573-586 (1996).
- Edman, K. A. The velocity of unloaded shortening and its relation to sarcomere length and isometric force in vertebrate muscle fibres. J Physiol. 291, 143-159 (1979).
- Brenner, B., Eisenberg, E. Rate of force generation in muscle: Correlation with actomyosin ATPase activity in solution. PNAS. 83, 3542-3546 (1986).
- Moss, R. L. The effect of calcium on the maximum velocity of shortening in skinned skeletal muscle fibres of the rabbit. J. Muscle Res. Cell Motil. 3, 295-311 (1982).
- Pate, E., Wilson, G. J., Bhimani, M., Cooke, R. Temperature dependence of the inhibitory effects of orthovanadate on shortening velocity in fast skeletal muscle. Biophys J. 66, 1554-1562 (1994).
- Ashley, C. C., Moisescu, D. G. Effect of changing the composition of the bathing solutions upon the isometric tension-pCa relationship in bundles of crustacean myofibrils. J Physiol. 270, 627-652 (1977).
- Godt, R. E. Calcium-activated tension of skinned muscle fibers of the frog. Dependence on magnesium adenosine triphosphate concentration. J Gen Physiol. 63, 722-739 (1974).
- Fabiato, A., Fabiato, F. Calculator programs for computing the composition of the solutions containing multiple metals and ligands used for experiments in skinned skeletal muscle cells. Journal de Physiologie (Paris). 75, 463-505 (1979).
- Chase, P. B., Kushmerick, M. J. Effect of physiological ADP concentrations on contraction of single skinned fibers from rabbit fast and slow muscles). Am J Physiol. 268, C480-C489 (1995).
- Godt, R. E., Maughan, D. W. Swelling of skinned muscle fibers of the frog. Biophysical Journal. 19, 103-116 (1977).
- Kawai, M., Wray, J. S., Zhao, Y. The effect of lattice spacing change on cross-bridge kinetics in chemically skinned rabbit psoas muscle fibers. Biophys J. 64, 187-196 (1993).
- Millman, B. M. The filament lattice of striated muscle. Physiol Rev. 78 (2), 359-391 (1998).
- Edman, K. A. Contractile properties of mouse single muscle fibers, a comparison with amphibian muscle fibers. J Exp Biol. 208, 1905-1913 (2005).
- Phillips, S. K., Woledge, R. C. A comparison of isometric force, maximum power and isometric heat rate as a function of sarcomere length in mouse skeletal muscle. Pflügers Archiv. 420, 578-583 (1992).
- Stephenson, D. G., Williams, D. A. Effects of sarcomere length on the force-pCa relation in fast and slow-twitch skinned muscle fibres from the rat. J Physiol. 333, 637-653 (1982).
