व्यवहार assays के लिए डाइंग कीड़े: Anesthetized के संभोग व्यवहार<em> ड्रोसोफिला</em
Summary
This protocol describes a simple, cost effective way to individually identify Drosophila or other insects. Demonstration data investigating mating success across three species of Drosophila show that this method is comparable or better than the use of CO2 anaesthesia.
Abstract
ड्रोसोफिला का उपयोग कर संभोग प्रयोगों यौन चयन और व्यवहार को समझने के लिए काफी योगदान दिया है। प्रयोगों अक्सर एक परीक्षण में व्यक्तियों के बीच भेद करने के लिए सरल, आसान और सस्ते विधियों की आवश्यकता है। इस के लिए एक मानक तकनीक प्रत्येक मक्खी कतरन सीओ 2 संज्ञाहरण और फिर लेबलिंग या दक्षिणपंथी है। हालांकि, इस आक्रामक है और व्यवहार को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है। अन्य तकनीकों मक्खियों की पहचान करने की रंगाई का इस्तेमाल किया है। यह लेख खाना रंग का उपयोग कर, उन्हें अलग-अलग प्रयोगों में पहचाना जा करने की अनुमति देता है कि लेबलिंग ड्रोसोफिला के लिए एक सरल और गैर इनवेसिव विधि प्रस्तुत करता है। इस विधि में दो पुरुषों के एक महिला के साथ दोस्त के लिए प्रतिस्पर्धा जहां परीक्षणों में प्रयोग किया जाता है। डाइंग त्वरित और आसान पहचान के लिए अनुमति दी। परीक्षण किया तीन प्रजातियों भर रंगाई की ताकत में कुछ अंतर है, हालांकि, वहाँ था। डाटा डाई दिखा प्रस्तुत किया है ड्रोसोफिला melano में सीओ 2 से संभोग के व्यवहार पर एक कम प्रभाव पड़ता हैgaster। सीओ 2 संज्ञाहरण के प्रभाव डी के साथ, ड्रोसोफिला की प्रजातियों पर निर्भर करने के लिए दिखाया गया है pseudoobscura और डी subobscura, डी, जबकि कोई प्रभाव नहीं दिखा मेलानोगास्टर पुरुषों को संभोग सफलता कम था। प्रस्तुत डाई विधि प्रयोगात्मक डिजाइन की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू है।
Introduction
पिछले कुछ दशकों में वहाँ विकास 1,2 पर कैसे यौन चयन और प्रतियोगिता के पुरुषों के बीच प्रभाव में रुचि बढ़ रही है। संभोग के व्यवहार पर प्रयोगों के विकास और यौन चयन 3,4 के सिद्धांतों का परीक्षण करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है। जीनस ड्रोसोफिला की विशेष, अनुसंधान का उपयोग प्रजातियों में, यौन चयन और व्यवहार को समझने के लिए बहुत योगदान दिया। हालांकि, यह आमतौर पर इस्तेमाल किया तकनीकों मानक संभोग प्रयोगों 5,6 के परिणामों को कृत्रिम रूप से पूर्वाग्रह हो सकता है कि क्या जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है।
अनेस्थेसिया अक्सर प्रयोगों के सात में से निपटने और पहचान के लिए प्रयोग किया जाता है। उदाहरण के लिए, मक्खियों आमतौर पर संभोग से पहले एकत्र कर रहे हैं, या (सीओ 2) संवेदनाहारी कार्बन डाइऑक्साइड का उपयोग कर जीनोटाइप या प्रयोगात्मक उपचार में हल। दो या दो से अधिक व्यक्तियों को प्रतिष्ठित किया जा करने की जरूरत है, जहां प्रयोगों में, यह फ्लोरिडा चतनाशून्य करना आम बात हैएँ और विंग बंद का क्लिप हिस्सा प्रत्येक व्यक्ति या इलाज के समूह 5,8 की पहचान करने के लिए। यह हालांकि, सीओ 2 के इलाज के व्यवहार को प्रभावित करेगा समझने के लिए कैसे, महत्वपूर्ण है। सीओ 2 संज्ञाहरण के प्रभाव ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में जांच की गई है, जिसमें दो दोस्त के लिए अब काफी लिया और समग्र गैर anaesthetized पुरुषों या पुरुषों की तुलना में कम संभोग सफलता मिली ठंड से 5 लोगों तक पहुंचाने का उपयोग कर anaesthetized सीओ के संपर्क में पुरुषों। इस आशय मनाया गया दोनों संज्ञाहरण प्रयोग के दिन पर लागू किया गया था और जब मक्खियों ठीक करने के लिए एक दिन दिए गए थे। हालांकि, इस अध्ययन के लिए एक भी पुरुष प्रत्येक महिला 5 के समक्ष प्रस्तुत किया गया था, जहां केवल की जांच परीक्षणों में ही सीमित था। एक महिला होने के कारण संज्ञाहरण के लिए पुरुष फिटनेस के अधिक सूक्ष्म घाटे का पता लगाने की अनुमति हो सकता है जो पुरुषों के बीच प्रतिस्पर्धा की अनुमति देता है, कई पुरुषों 9,10 मुठभेड़ करने के लिए के लिए एक और अधिक यथार्थवादी परिदृश्य है। सीओ 2 संज्ञाहरण का उपयोग भी किया जा चुका हैएन वयस्क डी का उपजाऊपन और दीर्घायु को कम करने के लिए मिला वे eclosion के बाद शीघ्र ही उजागर कर रहे हैं जब कुंवारी का संग्रह 11 मक्खियों जब आम है, के रूप में मेलानोगास्टर।
2 संज्ञाहरण सह के लिए एक वैकल्पिक उन्हें डाई 4,6,10,12,13 के साथ रंग का खाना खिलाने से मक्खियों चिह्नित करने के लिए है। इस डाई रंग का मक्खियों uncolored मक्खियों से, या एक अलग रंग के साथ लेबल मक्खियों से प्रतिष्ठित किया जा करने की इजाजत दी, मक्खी की आंतों में प्रवेश करती है और पेट के माध्यम से दिख रहा है। रंगे अनुपूरक खमीर पेस्ट 6 के माध्यम से, या एक उपन्यास रंगे भोजन सब्सट्रेट 13 के लिए जोखिम के माध्यम से, भोजन से 12 सीधे जोड़ा जा रहा है: तरीके कैसे इस आवेदन किया जा सकता है में मतभेद है। ये अंकन तकनीक संभोग प्रदर्शन 4,6 पर कोई प्रभाव दिखाने के लिए दिखाई देते हैं। हालांकि, एक कागज सीधे वयस्क डी पर एक ही रंग भोजन के प्रभाव की जांच मेलानोगास्टर उम्र 14 में एक मजबूत कमी पाया। पिछला काम भी एएलएम ध्यान केंद्रित किया हैकमजोर पक्ष पूरी तरह से डी पर मेलानोगास्टर, दोनों सीओ 2 संज्ञाहरण 5,11 और खाद्य रंग 14 के तरीकों के प्रभाव के संबंध में। वर्तमान में, सीओ 2 संज्ञाहरण या आंतों रंग का उपयोग अन्य ड्रोसोफिला के संभोग व्यवहार को प्रभावित करता है पर बहुत कम जानकारी है।
निम्नलिखित अध्ययन ड्रोसोफिला की तीन प्रजातियों (डी मेलानोगास्टर, डी pseudoobscura, और डी subobscura) के संभोग व्यवहार पर सीओ 2 संज्ञाहरण के प्रभाव का मूल्यांकन करता है। सीओ 2 पर मक्खियों इकट्ठा करने का प्रभाव एकल और दो पुरुष संभोग परीक्षणों दोनों में जांच की गई थी। सीओ 2 का प्रभाव भी डी में भिन्नता पाई गई है मेलानोगास्टर 5 और 2 सीओ करने के लिए जोखिम और संभोग के बीच बहुत अलग विलंबता अवधि परीक्षण किया गया। संज्ञाहरण और विंग क्लिपिंग के लिए विधि अंकन एक वैकल्पिक: मक्खियों दाग खाद्य रंगों का प्रयोग भी मूल्यांकन किया जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस डेटा में सीओ 2 संज्ञाहरण के प्रभाव को थोड़ा प्रभाव दिखा दो से तीन की प्रजातियों के साथ, प्रजातियों के बीच असंगत है कि पता चलता है। हमारे परिणाम भोजन डाई के साथ लेबलिंग दो संज्ञाहरण डी के लिए सीओ से पुरुष संभोग सफलता पर एक कम प्रभाव पड़ा का सुझाव मेलानोगास्टर। इन प्रयोगों खाद्य रंगों को आसानी से और सस्ते में कई पुरुषों को शामिल संभोग assays के लिए लेबल मक्खियों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि प्रदर्शित करता है।
तीन मॉडल ड्रोसोफिला प्रजातियों में से केवल डी की जांच की मेलानोगास्टर एक प्रतिस्पर्धी स्थिति में संभोग के प्रदर्शन पर सीओ 2 संज्ञाहरण का एक प्रभाव दिखाया। इसके विपरीत, प्रजातियों में से कोई भी डी के लिए पिछले परिणामों के विपरीत संभोग विलंबता, के संदर्भ में ही संभोग के परीक्षणों में गैस पर संग्रह का एक प्रभाव दिखाया मेलानोगास्टर 5। प्रतियोगिता का प्रभाव इसलिए केवल detectable हैं जो सीओ 2 संज्ञाहरण के अधिक सूक्ष्म फिटनेस प्रभाव पर प्रकाश डाला जा सकता हैस्थितियों के तहत पुरुष-पुरुष प्रतियोगिता है, जहां। जल्दी संग्रह और एक दिन में एक्सपोजर परीक्षण करने से पहले डी के पुरुषों की क्षमता पर नकारात्मक असर पड़ेगा एक संभोग हासिल करने के लिए मेलानोगास्टर। दो दिन पहले परीक्षण के लिए एक्सपोजर हालांकि कोई असर नहीं दिखा था। डी दोनों pseudoobscura और डी subobscura परीक्षणों में से किसी में गैस के लिए जोखिम का कोई असर नहीं दिखा था। एक स्पष्टीकरण यह है कि डी पुरुषों कुंवारी हैं सुनिश्चित करने के लिए अन्य प्रजातियों की तुलना में – (6 घंटा पुराने 0) यह पहले के जीवन में एकत्र किया जाना चाहिए क्योंकि मेलानोगास्टर सीओ 2 के लिए जल्दी प्रदर्शन की चपेट में था। इसलिए पुरुष डी मक्खी की छल्ली अभी भी कड़ा करने के लिए उनके छल्ली के लिए लंबे समय तक पड़ा है जो अन्य प्रजातियों की तुलना में सख्त है के रूप में इस उम्र के मेलानोगास्टर अधिक संवेदनशील हो सकता है। सामान्य में, इस सीओ 2 संज्ञाहरण के प्रभाव विशिष्ट प्रजातियों और उचित रूप से अपने लक्ष्य प्रजातियों में प्रभाव का परीक्षण करना चाहिए जांचकर्ताओं हैं कि विचार का समर्थन करता है। Currentlवाई, सीओ 2 संज्ञाहरण के प्रभाव पर काम के बहुमत अन्य संबंधित प्रजातियों के लिए लागू करने के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता इसलिए ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर 5,11,22 पर बाहर किया और दिया गया है।
मक्खियों अंतर करने के लिए प्रस्तुत वैकल्पिक गैर इनवेसिव विधि भोजन डाई है। परिणाम इस इलाज के सभी प्रजातियों की जांच भर में कोई प्रभाव नहीं पड़ा सुझाव देते हैं। इसके उपयोग के व्यक्तियों के बीच भेद के लिए एक सस्ता और आसानी से दिखाई मार्कर प्रदान करने में सफल रहा था, जबकि हालांकि, यह डाई डी में भेद करने के लिए आसान हो गया था कि ध्यान दिया जाना चाहिए pseudoobscura और डी डी में से subobscura मेलानोगास्टर। पिछले लेखकों 4,6 (हरे और नीले रंग लाल,) कई रंगों का इस्तेमाल किया है। हम, डी सभी प्रजातियों में भेद करने के लिए सबसे आसान विशेष रूप से होना करने के लिए नीले रंग पाया pseudoobscura और डी subobscura। संभावित कई व्यक्तिगत रूप से चिह्नित flie के साथ और अधिक जटिल प्रयोगों की अनुमति होगी कई रंगों का प्रयोगएस। कुछ खाद्य रंगों का सेवन जब संभवतः पचा जा रहा है, मक्खियों रंग करने के लिए असफल के रूप में हालांकि, विभिन्न रंगों के प्रारंभिक परीक्षण, आवश्यक हैं। अन्य रंगों) विषाक्त प्रभाव है और मक्खियों के अस्तित्व को कम करने, और 14 से बचा जाना चाहिए सकता है। और अधिक महंगा दाग का उपयोग कर वैकल्पिक रंग भोजन के तरीकों को भी डी के लिए आंतों की अखंडता की जांच के लिए इस्तेमाल किया गया है 23 मेलानोगास्टर। ये एक विकल्प प्रदान कर सकता है, हालांकि अधिक महंगा है, रंगाई विधि 23।
मक्खियों संग्रह से रंगे भोजन पर संग्रहीत किया जा सकता है के रूप में डाई विधि सीओ 2 विंग क्लिपिंग के रूप में के रूप में जल्दी है। भोजन के तेज (~ 3 घंटा) तेजी से किया गया था, ताकि अन्य अध्ययनों से 6 में उपयोग के रूप में रंगीन भोजन पर भंडारण हे / एन इसके अलावा, मक्खियों चिह्नित करने के लिए पर्याप्त होगा। (- 12 दिन 10) 24 अंकन विंग (स्थायी) कतरन या फ्लोरोसेंट धूल की तुलना में – (5 घंटा ~ 4) हालांकि, रंग की अवधि अपेक्षाकृत कम है। ड्रोसोफिला प्रजाति के रूप मेंदिखने में भिन्नता है, विभिन्न रंगों और अधिक या कम विभिन्न प्रजातियों के लिए प्रभावी हो जाएगा, और कुछ उपभेदों के रूप में (जैसे, नाक आउट म्यूटेंट) आहार में परिवर्तन करने के लिए असुरक्षित हो सकता है, डाई के किसी भी उपयोग अपनी प्रभावशीलता का प्रारंभिक परीक्षण विशेष रूप से लंबे समय तक अगर आवश्यकता है रंगों के लिए अवधि के जोखिम 14 विषाक्त हो सकता है। Kalaw एट अल। 14 से अध्ययन करने के लिए इसके विपरीत, हम डी के लिए रंगीन खाद्य पदार्थों पर कई दिनों के लिए भंडारण के बाद कोई महत्वपूर्ण मृत्यु दर पाया मेलानोगास्टर (3 दिन), डी pseudoobscura (5 दिन), या डी subobscura (7 दिन), शायद के कारण रंग में अंतर करने के लिए प्रयोग किया जाता है।
डाई तकनीक के सफल प्रयोग के लिए महत्वपूर्ण कदम चुना डाई प्रजातियों और तनाव का इस्तेमाल किया जा रहा है के साथ अच्छी तरह से काम करता है कि मान्य 1.5 कदम है। एक वैकल्पिक तकनीक क्षेत्र प्रयोगों 24 में उपयोग करने के लिए पूर्व मक्खी के बाहर करने के लिए रंग धूल को लागू करने में शामिल है। इस विधि के क्षेत्र की वजह से टी में व्यक्तियों पर नज़र रखने के लिए इस्तेमाल किया गया हैओ अंकन की अवधि और अंकन बड़े पैमाने पर की आसानी 24 मक्खियों। हम स्पष्ट रूप से संभोग के परीक्षणों में इस पद्धति का परीक्षण नहीं किया है, यद्यपि यह धूल विशेष रूप से ड्रोसोफिला 25, 26 में, संभोग में महत्वपूर्ण इंद्रियों पर हो सकता है कि किसी भी प्रभाव की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण होगा। प्रजातियों में, हालांकि, आंतों की रंगाई संभव नहीं है जहां, इन तरीकों उपयुक्त हो सकता है।
अंत में हम परीक्षण तीन प्रजातियों (डी pseudoobscura और डी subobscura) में से दो में सीओ 2 संज्ञाहरण या पुरुषों के संभोग की क्षमता पर रंग भोजन या तो पाया कोई प्रभाव नहीं था कि वहाँ पाया। डी के लिए पता चला था सीओ 2 संज्ञाहरण के एक नकारात्मक प्रभाव मेलानोगास्टर, लेकिन खाना रंग इस प्रजाति में सफलता संभोग को प्रभावित नहीं किया। कुल मिलाकर, डाई विधि बराबर या सीओ 2 संज्ञाहरण की आवश्यकता है कि तरीकों की तुलना में बेहतर है कि अलग-अलग ड्रोसोफिला की पहचान करने के लिए एक सरल और सस्ते गैर इनवेसिव तरीका प्रदान करता है। यहसंभव है कि यह विधि प्रजातियों में से एक रेंज भर में काम होता है।
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम संभोग परीक्षण के साथ उनकी मदद के लिए एलेक्स Hitchen और मेग बूथ को धन्यवाद देना चाहूंगा। इस काम टी.पी. को H015604 / 1 / NERC अनुदान पूर्वोत्तर के द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| Plastic tubing | Fisher Scientific | TWT-200-061G | Other tubing may be suitable however it must fit within a 1ml pipette tip. |
| Fine mesh | Any haberdashery | – | Fine curtain mesh is suitable |
| 1ml pipette tips | VWR | 83007-376 | Various brands of pipette tips would be suitable |
| Plastic Vials | Sarstedt | 58.49 | Larger vials or bottles could also be used. |
| Cotton Balls | Lewis Medical Solutions | 28170 | The size of cotton will vary depending on the size of vials used |
| Blue Food colouring | Thesugarcraftcompany | – | Other dye colours and brands can have variable results. |
| CO2 Tank | BOC | BOC 40VK | |
| Sharpie Markers | Steadtler | Lumocolor 313 S | Various colours can be used, but Lumocolor S give an excellent combination of durability and fineness |
| Stopwatch | Salter | SL3920 | Any stopwatch with a good digital display would be fine |
Riferimenti
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