This protocol describes a simple, cost effective way to individually identify Drosophila or other insects. Demonstration data investigating mating success across three species of Drosophila show that this method is comparable or better than the use of CO2 anaesthesia.
ניסויי הזדווגות באמצעות תסיסנית תרמו רב להבנה של בחירה והתנהגות מיניות. ניסויים לעתים קרובות דורשים שיטות פשוטות, קלה וזולה להבחין בין פרטים במשפט. טכניקה סטנדרטית לכך היא CO 2 הרדמה ולאחר מכן תיוג או אגף גזיר כל זבוב. עם זאת, זה פולשני והוכח משפיע על התנהגות. טכניקות אחרות השתמשו בצבע לזהות זבובים. מאמר זה מציג שיטה פשוטה ולא פולשנית לתיוג תסיסנית המאפשרת להם להיות מזוהים בנפרד בתוך ניסויים, באמצעות צבע מאכל. שיטה זו משמשת בניסויים שבו שני גברים להתחרות להזדווג עם נקבה. צביעה אפשרה זיהוי מהיר וקל. היה, עם זאת, כמה הבדל בכוחו של הצבע על פני שלושת המינים שנבדקו. הנתונים מוצגים מראים את הצבע יש השפעה נמוכה יותר על התנהגות חיזור מאשר CO 2 בmelano דרוזופילהגסטר. ההשפעה של ההרדמה CO 2 מוצגת לסמוך על המינים של דרוזופילה, עם ד ' פסאודו וד ' subobscura מראה שום השפעה, ואילו ד הזכרים melanogaster הפחיתו הצלחת הזדווגות. שיטת הצבע המוצגת הינה ישימה למגוון רחב של עיצובים ניסיוניים.
בעשרות השנים האחרונות יש כבר עניין גובר באופן מיני בחירה ותחרות בין הזכרים השפעה על האבולוציה 1,2. ניסויים בהתנהגות חיזור שיחקו תפקיד חשוב בפיתוח ובדיקת תאוריות של ברירה מינית 3,4. במינים של סוג מסוימים דרוזופילה, מחקר באמצעות, תרם רב להבנה של בחירה והתנהגות מיניות. עם זאת, חשוב לבדוק האם טכניקות נפוצות עשויות באופן מלאכותי להטות את התוצאות של ניסויי הזדווגות סטנדרטיים 5,6.
אלחוש משמש לעתים קרובות לטיפול וזיהוי בניסויים 7. לדוגמא, זבובים נאספים בדרך כלל לפני ההזדווגות, או מיון לגנוטיפים או טיפולים ניסיוניים באמצעות פחמן דו חמצני הרדמה (CO 2). בניסויים שבם שני אנשים או יותר צריכים להיות מכובדים, הוא מנהג נפוץ לְאַלחֵשׁ flies וחלק קליפ של האגף מעל לזהות כל קבוצה בודדת או טיפול 5,8. זה חיוני, עם זאת, כדי להבין כיצד CO 2 ישפיע טיפול על התנהגות. ההשפעה של CO 2 הרדמה נבדקה בדרוזופילה melanogaster שבן גברים נחשף ל- CO 2 לקחו באופן משמעותי יותר להזדווג וכולל הייתה הצלחת הזדווגות נמוכה מזכרים או זכרים-מורדם אינם מורדמים באמצעות חשיפה ל5 קרים. השפעה זו נצפתה גם כאשר ההרדמה יושמה ביום של הניסוי וכאשר זבובים קיבלו יום אחד להתאושש. עם זאת, מחקר זה היה מוגבל בניסויי בחינה היחידה שבו זכר יחיד שהוצג לכל נקבה 5. תרחיש מציאותי יותר הוא לנקבה להיתקל זכרים מרובים 9,10, המאפשרת תחרות בין זכרים, שעשוי לאפשר זיהוי של הפסדים עדינים יותר של כושר גברי עקב הרדמה. השימוש בהרדמת CO 2 גם להיותen נמצא להפחית פוריות ואריכות ימיו של ד 'למבוגרים melanogaster כאשר הם נחשפים זמן קצר לאחר eclosion, כמקובל בעת איסוף בתולה טס 11.
חלופה ל- CO 2 הרדמה היא לסמן זבובים על ידי האכלה להם אוכל בצבע עם צבע 4,6,10,12,13. צבע זה נכנס למעיים של הזבוב וגלוי דרך הבטן, המאפשר זבובים צבעוניים כדי להבחין בין זבובים צבועים, או מזבובים שכותרתו עם צבע שונה. שיטות שונות בכיצד ניתן ליישם את זה: להתווסף ישירות למזון 12, באמצעות שמרים משלימים להדביק צבוע 6, או באמצעות חשיפה לרומן צבוע מצע מזון 13. טכניקות לציון אלה מופיעים להראות שום השפעה על ביצועי 4,6 הזדווגות. עם זאת, נייר ישירות בוחן את ההשלכות של אותו צבע מאכל על מבוגר ד melanogaster מצא הפחתה משמעותית בתוחלת חיים 14. העבודה קודמת התמקדה גם ALMost כולו על ד ' melanogaster, הן בנוגע להשפעות של CO 2 הרדמה 5,11 וצבע מאכל 14 שיטות. נכון לעכשיו, יש מעט מידע על איך CO 2 הרדמה או השימוש בצביעת מעיים משפיעה על התנהגות החיזור של דרוזופילה אחרת.
המחקר הבא מעריך את ההשפעה של CO 2 הרדמה על התנהגות החיזור של שלושה מינים של דרוזופילה (melanogaster ד, ד 'פסאודו, וsubobscura ד). ההשפעה של איסוף זבובים על CO 2 נבדקה בשני שני ניסויי הזדווגות זכר אחד ו. ההשפעה של CO 2 נמצאה גם לגוון בד melanogaster 5 ותקופות זמן אחזור כל כך שונות בין החשיפה ל- CO 2 והזדווגות נבדקו. אלטרנטיבה לציון שיטה לגזיר הרדמה ואגף: השימוש בצבעי מזון להכתים את הזבובים גם העריכו.
הנתונים אלה מראה כי ההשפעה של ההרדמה CO 2 אינה עולה בקנה בין מינים, עם שניים משלושה מינים מראים השפעה מועטת. התוצאות שלנו מראות תיוג עם צבע מזון הייתה השפעה נמוכה יותר על הצלחת הזדווגות זכר מאשר CO 2 הרדמה לד melanogaster. ניסויים אלה מראים כי צבעים מאכל יכול בקלות ובזול לשמש לזבובי תווית עבור מבחני הזדווגות מעורבים זכרים מרובים.
של מיני תסיסנית שלושה מודל נבחן, רק ד ' melanogaster הראה השפעה של CO 2 הרדמה על ביצועי הזדווגות במצב תחרותי. בניגוד לכך, אף אחד מהמינים הראה השפעה של אוסף על גז בניסויי הזדווגות אחת במונחים של זמן אחזור הזדווגות, בניגוד לתוצאות קודמות לד melanogaster 5. ההשפעה של תחרות ולכן יכולה להיות הדגשת השפעות עדינות יותר כושר של הרדמה CO 2, שהם רק לזיהויתחת מצבים שבם יש תחרות גברית-גברית. חשיפה באוסף מוקדם ויום אחד לפני המשפט יש לו השפעה שלילית על היכולת של גברים של ד ' melanogaster כדי לקבל הזדווגות. חשיפה יומיים לפני המשפט זאת לא הראתה כל השפעה. שני ד פסאודו וד ' subobscura לא הראה שום השפעה של חשיפה לגז בכל אחד מהניסויים. הסבר אחד הוא שד melanogaster היה פגיע לחשיפה המוקדמת לCO 2 כי זה חייב להיות שנאסף מוקדם יותר בחיים (0-6 שעות ישנות) מאשר המינים האחרים על מנת להבטיח זכרים בתולה. ד כאן גברי melanogaster בגיל זה עלול להיות רגיש יותר כמו הציפורן של הזבוב עדיין התקשות, בהשוואה למינים האחרים שיש לו יותר לציפורן שלהם להקשיח. באופן כללי, זה תומך ברעיון כי ההשפעות של CO 2 הרדמה הן מינים ספציפיים וחוקרים צריכים הולם לבחון את ההשפעה של מיני היעד שלהם. Currently, רוב העבודה על ההשפעה של CO 2 הרדמה בוצע על melanogaster תסיסנית 5,11,22 ולכן לא יכול להיות מתאים לפנות למינים קרובים אחרים.
השיטה לא פולשנית החלופית שהוצגה כדי לבדל את הזבובים היא צבע מזון. תוצאות מצביעות על עבר את הטיפול הזה אין כל השפעה בכל המינים שנבדקו. עם זאת, בעוד שהשימוש בו היה מוצלח במתן סמן זול וגלוי בקלות להבחנה בין יחידים יש לציין שהצבע היה קל יותר להבחין בד פסאודו וד ' subobscura מאשר בד המחברים melanogaster. קודמים השתמשו בכמה צבעים (אדום, ירוק וכחול) 4,6. מצאנו צביעה כחולה להיות הקל ביותר להבחין בכל המינים, במיוחד ד פסאודו וד ' subobscura. שימוש במספר צבעים שעלולים היה לאפשר ניסויים מורכבים יותר עם לנשור רבים מסומן בנפרדs. עם זאת, בדיקות ראשוניות של צבעים שונים הן חיוניות, כמו כמה צבעים מאכל לא מצליחים לצבוע את הזבובים, אולי מתעכלים כאשר הוא נצרך. צבעים אחרים יכולים להיות השפעה רעילה ולהפחית הישרדות של הזבובים, ויש להימנע 14). שיטות צביעת מזון חלופיות באמצעות כתמים יקרים יותר יש גם שימשו לבחינת שלמות מעיים לד melanogaster 23. אלה עשויים לספק חלופה, אם כי יקרים יותר, שיטת צביעת 23.
שיטת הצבע היא מהירה כמו CO 2 גזיר אגף כפי שניתן לאחסן זבובים על מזון צבוע מאוסף. הספיגה של המזון הייתה מהירה (~ 3 שעות), כך O האחסון / N על מזון צבעוני יהיה גם מספיק כדי לסמן זבובים, המשמש במחקרים אחרים 6. עם זאת, משך הזמן של הצביעה הוא קצר יחסית (~ 4 – 5 שעות) בהשוואה לחיתוך כנף (קבוע) או אבק ניאון לציון (10 – 12 ימים) 24. כמיני דרוזופילהלהשתנות במראה, צבעים שונים יהיו פחות או יותר יעיל למינים שונים, וכפי שכמה זנים (למשל, מוטציות נוק-אאוט) יכולות להיות חשופות לשינויים בדיאטה, כל שימוש בצבע דורש בדיקה ראשונית של האפקטיביות שלה במיוחד אם כבר חשיפה ארוכת לצבעים יכולה להיות רעילה 14. בניגוד למחקר של Kalaw et al. 14, לא מצאנו תמותה משמעותית לאחר האחסון במשך ימים רבים על מזונות צבעוניים לד melanogaster (3 ימים), ד ' פסאודו (5 ימים), או ד ' subobscura (7 ימים), ככל הנראה בשל ההבדל בצבע משמש.
השלב הקריטי לשימוש מוצלח של טכניקת הצבע הוא צעד 1.5, אימות שהצבע שנבחר עובד היטב עם המינים ומתח בשימוש. טכניקה חלופית כרוכה החלת אבק בצבע לצד החיצוני של הזבוב לפני השימוש בניסויי שדה 24. שיטה זו נעשתה שימוש למעקב אחר אנשים בt בשל השדהo משך סימון והקלות המונית לציון טס 24. למרות שיש לנו באופן מפורש שנבדקו בשיטה זו בניסויי הזדווגות, זה יהיה חשוב לבחון תופעות שיכול להיות לי אבק על החושים החשובים בהזדווגות, במיוחד ב -25 דרוזופילה, 26. במינים, לעומת זאת, שבו צביעת מעיים אינה אפשרית, שיטות אלה יכולים להיות מתאימות.
לסיכום מצאנו כי בשתיים משלושת המינים שנבדקו (ד 'פסאודו-וsubobscura ד) לא הייתה השפעה של כל אחד מצאה CO 2 הרדמה או צבעי מאכל על יכולת הזדווגות של זכרים. לד melanogaster השפעה שלילית של CO 2 הרדמה זוהתה, אך צבעי מאכל לא השפיעו על הזדווגות הצלחה במין זה. בסך הכל, בשיטת הצבע מספקת שיטה לא פולשנית פשוטה וזולה לזיהוי תסיסנית פרט שהוא שווה ערך או טוב יותר מאשר שיטות שדורשות CO 2 הרדמה. זהסביר להניח בשיטה זו תעבוד על פני מגוון של מינים.
The authors have nothing to disclose.
ברצוננו להודות לאלכס Hitchen ומג בות 'לעזרתם עם ניסויי ההזדווגות. עבודה זו נתמכה על ידי NE מענק NERC / H015604 / 1 לTP.
Plastic tubing | Fisher Scientific | TWT-200-061G | Other tubing may be suitable however it must fit within a 1ml pipette tip. |
Fine mesh | Any haberdashery | – | Fine curtain mesh is suitable |
1ml pipette tips | VWR | 83007-376 | Various brands of pipette tips would be suitable |
Plastic Vials | Sarstedt | 58.49 | Larger vials or bottles could also be used. |
Cotton Balls | Lewis Medical Solutions | 28170 | The size of cotton will vary depending on the size of vials used |
Blue Food colouring | Thesugarcraftcompany | – | Other dye colours and brands can have variable results. |
CO2 Tank | BOC | BOC 40VK | |
Sharpie Markers | Steadtler | Lumocolor 313 S | Various colours can be used, but Lumocolor S give an excellent combination of durability and fineness |
Stopwatch | Salter | SL3920 | Any stopwatch with a good digital display would be fine |