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Neuroscienze

Färben Insekten für Verhaltenstests: die Paarungsverhalten von narkotisierten<em> Drosophila</em

Published: April 22, 2015
doi:
10.3791/52645
, ,
1Institute of Integrative Biology,University of Liverpool

Summary

This protocol describes a simple, cost effective way to individually identify Drosophila or other insects. Demonstration data investigating mating success across three species of Drosophila show that this method is comparable or better than the use of CO2 anaesthesia.

Abstract

Gegen Experimente mit Drosophila haben erheblich zum Verständnis der sexuellen Selektion und das Verhalten bei. Experimente erfordern oft einfache, leichte und billige Methoden, um zwischen den Individuen in einer Studie zu unterscheiden. Ein Standard-Technik dafür ist, CO 2 Anästhesie und Beschriftung oder Flügel Clipping jede Fliege. Dies ist jedoch invasiv und ist gezeigt worden, um das Verhalten zu beeinflussen. Andere Techniken Färbung verwendet werden, um Fliegen zu identifizieren. Dieser Artikel stellt eine einfache und nicht-invasive Methode zur Kennzeichnung von Drosophila, die sie einzeln in Experimenten identifiziert werden können, mit Lebensmittelfarbe. Dieses Verfahren ist in Studien, in denen zwei Männchen konkurrieren mit einem weiblichen paaren verwendet. Färbung erlaubt eine schnelle und einfache Identifikation. Es gab jedoch einige Unterschiede in der Stärke der Färbung in den drei untersuchten Spezies. Daten präsentiert, die den Farbstoff eine geringere Auswirkungen auf das Paarungsverhalten als CO 2 di Drosophila melanoGaster. Die Auswirkungen des CO 2 Anästhesie gezeigt, von der Spezies des Drosophila abhängen, wobei D. pseudoobscura und D. subobscura zeigt keinen Einfluss, während D. melanogaster Männchen hatte Paarungserfolg reduziert. Die vorgelegte Farbstoff Verfahren ist anwendbar auf einen weiten Bereich von experimentellen Designs.

Introduction

In den letzten Jahrzehnten gab es eine wachsende Interesse daran, wie die sexuelle Selektion und Konkurrenz zwischen Männern Auswirkungen auf Evolution 1,2. Versuche über das Paarungsverhalten eine wichtige Rolle in der Entwicklung und Erprobung Theorien der sexuellen Selektion 3,4 gespielt. Insbesondere die Forschung mit Arten der Gattung Drosophila, hat entscheidend zum Verständnis der sexuellen Selektion und das Verhalten bei. Jedoch ist es wichtig zu untersuchen, ob die allgemein verwendeten Techniken könnten künstlich spannen die Ergebnisse von Standardpaarungsexperimenten 5,6.

Anästhesie wird häufig für die Handhabung und Identifikation in Experimenten 7 verwendet. Beispielsweise werden üblicherweise entfernt vor der Paarung gesammelt oder in Genotypen oder experimentelle Behandlungen unter Verwendung von Kohlendioxid (CO 2) Narkose sortiert. In Experimenten, bei denen zwei oder mehr Personen unterschieden werden müssen, ist es üblich, die fl betäubener Jahren und Clip Teil des Flügels ab, jeden einzelnen oder Behandlungsgruppe 5,8 identifizieren. Es ist wichtig, jedoch zu verstehen, wie CO 2 Behandlung Verhalten beeinflussen. Die Wirkung von CO 2 Betäubung in Drosophila melanogaster untersucht worden, in dem exponierten Männchen zu CO 2 hat deutlich länger zu paaren und insgesamt hatten geringere Paarungserfolg als nicht-narkotisierten Männer oder Männer betäubt mit Erkältung 5. Dieser Effekt wurde beobachtet, sowohl bei der Anästhesie wurde am Tag des Experiments angewandt und wenn Fliegen wurden einen Tag gegeben zu erholen. Allerdings wurde diese Studie nur die Prüfung Prüfungen, bei denen ein einzelner Stecker wurde jedem weiblichen 5 dargestellt beschränkt. Ein realistischeres Szenario ist für eine weibliche, mehrere Männchen 9,10 begegnen, so dass der Wettbewerb zwischen Männern, die den Nachweis subtiler Verluste der männlichen Fitness durch Anästhesie ermöglichen könnten. Die Verwendung von CO 2 Betäubung auchen gefunden, Fruchtbarkeit und Langlebigkeit der erwachsenen D. reduzieren melanogaster, wenn sie kurz nach dem Schlüpfen ausgesetzt sind, wie es üblich ist bei der Erhebung Jungfrau fliegt 11.

Eine Alternative zu 2 Anästhesie CO ist es, Fliegen, indem er ihnen Nahrung mit Farbstoff 4,6,10,12,13 farbig markieren. Dieser Farbstoff dringt in die Eingeweide der Fliege und durch das Abdomen sichtbar sind, können gefärbt entfernt von ungefärbten entfernt oder von Fliegen mit einer anderen Farbe markiert unterscheiden. Verfahren unterscheiden sich darin, wie diese angewendet werden kann: direkt mit dem Nahrungsmittel 12 aufgenommen, über gefärbte Zusatz Hefepaste 6 oder durch Einwirkung auf eine neue gefärbte Nahrungsmittelsubstrats 13. Diese Markierungstechniken scheinen keinen Einfluss auf das Paarungsverhalten 4,6 zeigen. Aber eine Papier direkt Prüfung der Auswirkungen des gleichen Lebensmittelfarbe auf die Erwachsenen D. melanogaster fanden eine starke Reduzierung der Lebensdauer 14. Frühere Arbeiten haben auch konzentriert almost ganz auf D. melanogaster sowohl in Bezug auf die Auswirkungen der CO 2 Anästhesie 5,11 und Lebensmittelfarbstoff 14 Methoden. Derzeit gibt es wenig Informationen, wie CO 2 Anästhesie oder die Verwendung von Darm Färbung beeinflusst das Paarungsverhalten anderer Drosophila.

Die folgende Studie untersucht die Wirkung von CO 2 Anästhesie auf dem Paarungsverhalten von drei Arten von Drosophila (D. melanogaster, D. pseudoobscura und D. subobscura). Die Wirkung des Sammelns Fliegen auf CO 2 wurde in Einzel- und zwei männlichen Paarungsversuchen untersucht. Die Wirkung von CO 2 wurde auch gefunden, dass in D. variieren melanogaster 5 und so unterschiedliche Latenzzeiten zwischen der Exposition zu CO 2 und Gegen getestet. Eine alternative Kennzeichnungsmethode auf die Anästhesie und Flügel Clipping: die Verwendung von Lebensmittelfarben, um die Fliegen Fleck wird ebenfalls bewertet.

Protocol

1. Vorbereitung der Fly Lebensmittel mit Lebensmittelfarbe Nehmen Sie ein Standard Drosophila Fläschchen mit ca. 20 ml Nahrung im Boden (Abbildung 1). Verwenden Sie das folgende Rezept für Lebensmittelmischung mit 1 Liter kochendem Wasser: 10 g Agar 85 g Dextrose, 60 g Maismehl, 40 g Hefe, und rühren Sie für 5 min vom Sieden. 25 ml 10% nipagen sobald die Mischung auf 75 ° C abgekühlt. Nach dem Essen wurde abgekühlt und verfestigt, zwei Tropfen (etwa 0,5 bis 1 ml) der blauen Lebensmittelfarbe auf die Spitze der Nahrungs und über die ganze Oberfläche des Gefäßes verteilt (Abbildung 1). Verwenden Sie einen anderen Farbstoff, wenn bevorzugt. Die Speise für zwei Tage im Kühlschrank, so daß der Farbstoff durch die obere Schicht des Nahrungs absorbiert; dies vermeidet übermäßige Feuchtigkeit beschädigt die Fliegen während der Reifezeit. Fügen Sie ein kleines Stück Seidenpapier, wenn übermäßiger Feuchtigkeit immer noch ein Problem zu beflecken sich zusätzliche Feuchtigkeit und anschließendentfernen Sie es. Übertragungs fliegt auf das Lebensmittel entweder einzeln oder in Gruppen. Hinweis: Die Fliegen werden Darm Färbung innerhalb von 1 Tag auf der Essen platziert zu gewinnen. Alternativ voll die Fliegen auf dem gefärbten Lebensmittel vor dem Experiment (erhöhte Sterblichkeit während der Reifezeit nicht vor der Belastung durch Lebensmittelfarbe eingehalten) reifen. Überprüfen, ob die gefärbten Fliegen können von den nicht-gefärbte Fliegen leicht unterschieden werden. Wenn sie nicht unterschieden werden kann, die Schritte 1,1-1,4 mit entweder einer höheren Konzentration an Farbstoff oder einen anderen Farbstoff enthält. 2. Zwei männliche Gegen Studien mit Lebensmittelfarbe Zur Herstellung von Nachkommen, Einrichten mehrerer Fläschchen mit Paaren von weiblichen und männlichen Fliegen (für kleine Gruppen von Männern und Frauen sind auch geeignet, wenn auch darauf achten, dass Gedränge der Larven zu vermeiden). Lassen Sie die Weibchen Eier legen und bewegen Sie die Fliegen auf neue Fläschchen alle 5 – 7 Tage die. Speicher Fläschchen bei einer geeigneten Temperatur für die Spezies von Interesse (22 ° C foder D. pseudoobscura und D. subobscura und 25 ° C für D. melanogaster). Vor dem Sammeln experimentellen Fliegen Entfernen Sie alle Fliegen aus den Sammelflaschen zu einem bestimmten Zeitpunkt vor der Erhebung Männer und Frauen, um sicherzustellen, dass sie Jungfrauen (D. melanogaster sein – 6 Stunden bei 25 ° C, D. pseudoobscura – 18 h bei 22 ° C, und D. subobscura – 24 Stunden bei 22 ° C). Hinweis: Wenn Fliegen sind nicht natives dieser Wille Bias ihr Verhalten in Paarungsversuche 15. Shop und reifen männlichen einzeln in Standard 75 x 20 mm Kunststoffröhrchen (mit ~ 20 ml Lebensmittel). Dies vermeidet die negativen Auswirkungen auf die männliche Fortpflanzungsverhalten und Fitness bei einigen Arten zu sehen, wenn Männer in Gruppen 16 gehalten. Expose Hälfte Männchen auf die gewünschte Behandlungs (CO 2 Anästhesie in diesem Fall). Verwenden Sie einen CO 2 Matte oder tippen, um die Fliegen für die erforderliche Zeit aussetzen. Shop Hälfte males in jeder Behandlungs auf farbigen Lebensmitteln bis zur Paarung statt. Das macht sie während der Paarungsversuche visuell unterscheidbar. Für die Übertragung von Fliegen verwenden eines Gebläses 17. Beschriften Sie jedes Fläschchen, um sowohl die Behandlung und die Farbe Status der männlichen identifizieren. Hier verwenden vier Behandlungen (Anästhesie, nicht-farbige = G-NC, Anästhesie, farbige = GC, keine Narkose, nicht eingefärbten, NG-NC und keine Anästhesie, farbig, NG-C). Übertragen neu entstandenen Weibchen in frischen Lebensmitteln Fläschchen als Gruppen von 10 reifen. Zulassen entfernt, um zu der Paarungszeit (D. melanogaster reifen – 3 Nächte, D. pseudoobscura – 5 Tage, D. subobscura – 7 Tage die 18 Speicher fliegt bei einer geeigneten Temperatur für die Spezies untersucht (beispielsweise 22 ° C für D. . pseudoobscura und D. subobscura und 25 ° C für D. melanogaster). Bewegen Weibchen einzelnen Fläschchen (Fortsetzungaining ~ 20 ml Essen) 1 Tag vor der Paarung Studie zur Akklimatisierung mit dem passenden Fläschchen. Beschriften Sie diese Ampullen, so dass Fläschchen unterschieden werden. Achten Sie darauf, das Experiment, indem neutrale Kennzeichnung blenden (dh 1-150), so ist es nicht möglich, die Identität der Fliegen in jedem Fläschchen erraten. Hinweis: Die Person, die die Fliegen in jedem Fläschchen platziert wird, um die Identität der Fliegen in jedem Fläschchen platziert, wie sie werden feststellen, welche Behandlung war voller Flecken kennen. Jedoch sollte der Beobachter, der die passenden Uhren ihre Identität nicht. Um dies zu tun mindestens zwei Experimentatoren benötigt werden, eine Einrichtung und ein zu beobachten. Beginnen Sie die Paarungsversuche zwischen 10 – 12 Uhr, oder in einer Zeit, die mit dem Licht, das auf der Hell / Dunkel-Zyklus die Fliegen an ("Dawn" für die Linie) ausgesetzt zusammenfällt. Fügen Sie zwei männlichen Fliegen zu jedem passenden Fläschchen (mit einem einzigen Weibchen fly) unter Verwendung eines Gebläses. Stellen Sie sicher, dass die beiden Männer sind von verschiedenen Behandlungen (Anästhesie oderKontrolle) und dass man Darm Färbung, damit es möglich ist, sie voneinander zu unterscheiden, und beachten Sie, was männlich gefärbt wird. Wenn Paarung auftritt, notieren Sie den Status des männlichen, die Geschwister (entweder farbig oder nicht – farbig). Wenn Studien letzten 2 Stunden, davon ausgehen, das Weibchen nicht paaren. Anmerkung: 2 h ist für diese Spezies, aber andere Drosophila kann mehr oder weniger Zeit benötigen. 3. Single Penisgegen Trials Für einzelne männliche Studien, wiederholen Protokoll 2 mit zwei Änderungen: In Schritt 2.3 nicht halten Männer auf farbigem Essen. In Schritt 2.7, fügen Sie nur einen einzigen Stecker auf jeder Flasche. In Schritt 2.8, notieren Sie die Zeit die Fliege in die Ampulle, die Zeit beginnt der Paarung und die Zeit der Paarung fertig aufgezeichnet werden sollen aufgenommen. Aus diesen Werten berechnet Paarungserfolg, Latenzzeit und Dauer. 4. Datenanalyse Verwenden Sie geeignete Statistikpaket für anaLyse. Wenn die Daten normal und nur zwei Behandlungen, verwenden Sie t-Tests oder gleichwertig Generalized Linear Model (GLM). Für zwei männliche Experimente verwenden binomischen Tests oder eine binomische GLM, die in jeder Grund Statistik-Paket verfügbar sind. Hinweis: Für die Beispieldaten, alle Analysen wurden in R-Version 3.0.3 19 durchgeführt. Überprüfen der Paarungs Latenz und Paarung Dauerdaten auf Normalität, die durch Auftragen Frequenzhistogramme Latenz und Dauer für jede Behandlung 20 und mit einem Test auf Normalität wie Shapiro-Wilk. Wenn es nicht normal, zu transformieren, oder verwenden Sie nichtparametrische entsprechenden Statistiken 20. Hinweis: Für die Beispieldaten aus den einzigen männlichen Versuchs log-Transformation erfüllt die Anforderungen der Normalität und gleiche Varianzen. Wenn die Daten normalisiert werden, Gebrauch t-Tests, um Unterschiede zwischen den Paarungs Latenz und Dauer in den einzigen männlichen Paarungsversuche zu prüfen, wenn Sie zwei Behandlungen 21. Wenn mehrfache Behandlungen verwendet werden,versuchen eine Varianzanalyse (ANOVA) 20. Wenn die Daten nicht normiert werden können, äquivalente nicht-parametrischen Tests 21. Verwenden binomischen Tests auf einen Effekt der beiden Lebensmittelfarbe oder CO 2 Anästhesie auf dem Paarungserfolg von konkurrierenden Männchen 20 zu testen. Wenn mehrfache Behandlungen verwendet werden, wie es der Fall mit den Beispieldaten mit einem GLM mit binomischen Fehlerstruktur 21. Für die beiden männlichen Studien in den Beispieldaten verwenden GLMs mit binomischen Fehlerstrukturen. Eine GLM sucht Farbe als Zielgröße (farbig = 0, nicht gefärbtem = 1) mit Arten, Gaszustand und Gasbehandlung als erklär variables.One GLM sucht CO 2 als Zielgröße (vergast = 0 und nicht entgast ausgestattet = 1) mit Arten, Farbe Status und Gasaufbereitung ausgestattet. In jedem Fall produzieren die maximale Modell, und führen Modellvereinfachung auf der Grundlage AIC 20.

Representative Results

Zwei männliche Paarungsversuche – Die Wirkung von CO 2 Narkose auf das Paarungsverhalten Das beste Modell zu finden, um die Veränderung in der Wirkung der CO 2 Anästhesie erklären enthaltenen Spezies als Faktor (mit D. pseudoobscura und D. subobscura verschmolzen, da sie keine Unterschiede zwischen einander zeigte). In D. pseudoobscura und D. subobscura gab es keine signifikante Wirkung von CO 2 Narkose auf Paarungserfolg in zwei männliche Studien (Z 1,589 = 0,087, P = 0,931). Für D. melanogaster Männchen 2 Anästhesie CO ausgesetzt hatten signifikant niedrigere Paarungserfolg (Z1,589 = 2,467, p = 0,014). Es war auch eine signifikante Interaktion zwischen den Spezies und Behandlung (χ 2 = 1,589 6,83, P = 0,009) mit einer größeren Wirkung wird beobachtet, wenn D. melanogaster wurden um Gas bei Abholung oder 1 Tag vor Studien (Tabelle 1) ausgesetzt ist. Howeväh, D. melanogaster Männchen ausgesetzt zu CO 2 zwei Tage vor der experimentellen Studie hat einen Effekt der CO 2 nicht angezeigt. Zwei männliche Paarungsversuche – Die Wirkung von Darm-Färbung auf Paarungsverhalten Modellvereinfachung zeigte keine signifikante Wirkung von Lebensmittelfarbe, die für jede der drei Arten (P> 0,1) auf. Wenn die Behandlung oder Gasstatus wurden in die Analyse einbezogen waren ebenfalls nicht signifikant (P> 0,1). Die Anteile der erfolgreichen Paarungen für farbige fliegt über Behandlungen sind in Tabelle 2 dargestellt. Der Unterschied in der Färbung zwischen entfernt gehalten auf farbigen und farblosen Nahrung kann in 1 gesehen werden kann. Die Intensität des Darmlebensmittelfarbe war größer in D. pseudoobscura und D. subobscura als in D. melanogaster. Einzelpaarungsversuche – Der Effekt der Verwendung von CO 2 Narkose auf mtriebs Verhalten Es gab keinen Unterschied in der Paarungslatenzzeit für jede der drei Arten, wenn CO 2 Anästhesie wurde verwendet, um vor kurzem zu sammeln entstanden Erwachsene. Ein Effekt wurde für Paarungszeit in D. gefunden subobscura wenn er belichtet wurde, um CO 2 zwei Tage vor dem Paarungsversuche (Figuren 2 und 3; Tabelle 2). Abbildung 1: Foto mit Darstellung Phiolen Farbige und Nicht Farbige Fly Lebensmittel (A) und der Stärke der Darm Coloration in Male D. Subobscura (B). Abbildung 2. Der Mittelwert und 95% Konfidenzintervalle für Kopulation Latenz für die drei Arten in Single Penis Studien untersucht, wenn Männer waren betäubend (helle Balken) oder einem nicht betäubten (dunkle Balken), wenn sie als Jungfrauen vor der Geschlechtsreife gesammelt. Abbildung 3. Die Mittelwerte und 95% -Konfidenzintervalle für Kopulation Dauer für die drei Arten in Single Penis Studien untersucht, bei der Männer anästhesiert (helle Balken) oder einem nicht betäubten (dunkle Balken), wenn sie als Jungfrauen vor der Geschlechtsreife Gesammelte. Behandlung Spezies Nr Studien Nr Fliegen gefärbt, die gepaart p-Wert Nr Fliegen vergast, die gepaart p-Wert Sammlung auf CO 2 D. mel 73 36 1 27 0,0344 D. pse 79 41 0,8221 44 0,3682 D. Unter 71 40 0,3425 33 0,6353 Ausgesetzt zu 2 18 Stunden CO vor D. mel 57 28 1 19 0,0163 D. pse 65 32 1 31 0,8043 D. Unter 68 38 0,3961 35 0,9036 Ausgesetzt 2 2 Tage CO. D. mel 56 19 0,0222 32 0,3497 D. pse 70 32 0,5504 33 0,7202 D. Unter 56 29 0,8939 26 0,6889 </ Td> Tabelle 1 Ergebnisse von zwei Male Wahl Experimente Über alle Arten und Behandlungen untersucht. Spezies Eigenschaft df t-Wert p-Wert D. melanogaster Latenz 58 1,379 0,174 Dauer 58 1,243 0,221 D. pseudoobscura Latenz 109 0,419 0,676 Dauer 109 0,436 0,664 D. subobscura Latenz 83 0,098 0,922 Dauer 83 1,767 0,081 Tabelle 2: Ergebnisse von Einzelgegen Experimenten, die die Wirkung der Sammlung auf CO 2 Anästhesie auf der Gegenlatenzzeit und Dauer. Die Tests wurden an drei Arten von Drosophila (D. melanogaster, D. pseudoobscura und D. subobscura) durchgeführt.

Discussion

Diese Daten zeigen, dass die Wirkung von CO 2 Anästhesie inkonsistent zwischen Arten, mit zwei von drei Arten, das wenig Einfluss. Unsere Ergebnisse legen nahe Kennzeichnung mit Lebensmittelfarbe eine geringere Auswirkungen auf die männlichen Paarungserfolg als CO 2 Anästhesie für D. melanogaster. Diese Experimente zeigen, dass Lebensmittelfarben können leicht und billig zu Etikett Fliegen für die Paarung Tests mit mehreren Männern verwendet werden.

Von den drei Modell Drosophila-Arten untersucht, nur D. melanogaster zeigte eine Wirkung von CO 2 Narkose auf das Paarungsverhalten in einer Wettbewerbssituation. Im Gegensatz dazu, keine der Arten zeigten eine Wirkung der Sammlung auf Gas in einzelnen Paarungsversuche im Hinblick auf die Paarungs Latenz, im Gegensatz zu früheren Resultate für D. melanogaster 5. Die Auswirkungen des Wettbewerbs könnte daher sein Hervorhebung feiner Fitness Auswirkungen der CO 2 Anästhesie, die nur detektierbar sindunter Situationen, in denen Stecker-Stecker Wettbewerb. Exposure at frühen Sammlung und einen Tag vor der Verhandlung einen negativen Effekt auf die Fähigkeit der Männchen D. melanogaster, um eine Paarung zu gewinnen. Exposure 2 Tage vor der Verhandlung hat jedoch keinerlei Wirkung. Sowohl D. pseudoobscura und D. subobscura hatte keine Auswirkungen der Exposition gegenüber Gas in einer der Studien zeigen. Eine Erklärung dafür ist, dass D. melanogaster war anfällig für frühe Exposition gegenüber CO 2, weil es muss früher im Leben gesammelt werden (0-6 h alt) als die anderen Arten, um sicherzustellen, Männchen sind Jungfrau. Daher männlichen D. melanogaster dieser Zeit kann eine erhöhte Empfindlichkeit auf die Kutikula der Fliege noch Härten, verglichen mit den anderen Spezies, die mehr für die Kutikula aushärten gehabt. Im Allgemeinen unterstützt dies die Vorstellung, dass die Auswirkungen von CO 2 Anästhesie artspezifisch und Ermittler sollten entsprechend der Wirkung ihrer Zielarten. Currently, die Mehrzahl der Arbeiten über die Wirkung von CO 2 Anästhesie wurde an Drosophila melanogaster 5,11,22 geführt und deshalb nicht geeignet, um andere verwandte Arten anzuwenden.

Die vorgestellte, um Fliegen zu unterscheiden alternative nicht-invasive Methode ist Lebensmittelfarbe. Die Ergebnisse legen nahe diese Behandlung hatte keinen Einfluss auf über alle Arten untersucht. Während jedoch die Verwendung bei der Bereitstellung eines billigen und leicht sichtbarer Marker zur Unterscheidung zwischen Individuen erfolgreich war es sollte beachtet werden, dass der Farbstoff leichter in D. unterscheiden pseudoobscura und D. subobscura als in D. melanogaster. Vorherige Autoren haben verschiedene Farben (rot, grün und blau) 4,6 verwendet. Wir fanden, Blaufärbung der einfachste, in allen Arten zu unterscheiden D., insbesondere pseudoobscura und D. subobscura. Einsatz von mehreren Farben würde möglicherweise komplexere Experimente mit vielen einzeln gekennzeichnet flie ermöglichens. Es sind jedoch Vorversuche verschiedener Farbstoffe wichtig, da einige Lebensmittelfarben nicht, um die Fliegen zu färben, möglicherweise verdaut, als verbraucht wird. Andere Farbstoffe können eine toxische Wirkung haben und das Überleben der Fliegen zu verringern, und sollte vermieden werden 14). Alternative Lebensmittelfarbe Methoden unter Verwendung teurer Flecken wurden auch zur Untersuchung von Darmintegrität für D. verwendet melanogaster 23. Dabei kann es eine Alternative, wenn auch teurer, Färbeverfahren 23.

Der Farbstoff-Methode ist so schnell wie CO 2 Flügel Clipping wie Fliegen auf gefärbte Lebensmittel aus der Sammlung gespeichert werden. Die Aufnahme des Essens war schnell (ca. 3 h), so dass Speicher O / N auf farbigem Essen würde auch ausreichen, um Fliegen zu markieren, wie in anderen Studien 6 verwendet. Allerdings ist die Dauer der Färbung relativ kurz (~ 4-5 Stunden) im Vergleich zur Flügel Clipping (permanent) oder fluoreszierende Staub Kennzeichnung (10-12 Tage) 24. Da Drosophila-Artenunterscheiden sich in Aussehen, verschiedene Farbstoffe mehr oder weniger effektiv für die verschiedenen Arten sein, und da einige Stämme (zB Knockout-Mutanten) sind anfällig für Veränderungen in der Ernährung sein, jegliche Verwendung von Farbstoff erfordert eine Vorprüfung der Wirksamkeit vor allem, wenn mehr tige Exposition gegenüber giftigen Farbstoffe können 14 sein. Im Gegensatz zu der Studie von Kalaw et al. 14, fanden wir keine signifikante Mortalität nach einer Lagerung für mehrere Tage auf gefärbte Nahrungsmittel für D. melanogaster (3 Tage), D. pseudoobscura (5 Tage) oder D. subobscura (7 Tage), wahrscheinlich aufgrund des Unterschieds in Farbstoff verwendet.

Der entscheidende Schritt für den erfolgreichen Einsatz der Farbstoff Technik Schritt 1.5, Validierung, dass die gewählte Farbstoff eignet sich gut für die Art und Stamm verwendet. Eine alternative Technik beinhaltet die Anwendung farbigen Staub an der Außenseite des Fliegen vor in Feldversuchen 24 verwenden. Diese Methode ist für die Verfolgung von Personen auf dem Gebiet aufgrund t verwendeto die Dauer der Kennzeichnung und die Leichtigkeit der Massenmarkierung fliegt 24. Obwohl wir nicht explizit diese Methode in Paarungsversuche getestet, wäre es wichtig, alle Effekte, kann Staub auf die Sinne wichtig Paarung, insbesondere in Drosophila 25, 26 haben untersucht. Bei Arten jedoch, wo Darm Färben nicht möglich ist, diese Methoden geeignet sein könnten.

Abschließend haben wir festgestellt, dass in zwei der drei getesteten Arten (D. pseudoobscura und D. subobscura) gab es keine Wirkung entweder CO 2 Anästhesie oder Lebensmittelfarbe auf Paarungsfähigkeit von Männern gefunden. Für D. melanogaster eine negative Wirkung von CO 2 Anästhesie erkannt wurde, aber Lebensmittelfarbe hatte keinen Einfluss Paarung Erfolg in dieser Art. Insgesamt bietet der Farbstoff Verfahren eine einfache und kostengünstige nicht-invasive Methode zur Identifizierung einzelner Drosophila, die gleichwertig oder besser als die Methoden, die CO 2 Anästhesie erforderlich ist. Esist wahrscheinlich, diese Methode in einer Reihe von Arten zu arbeiten.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir möchten Alex Hitchen und Meg Stand für ihre Hilfe bei den Gegen Studien danken. Diese Arbeit wurde vom NERC Zuschuss NE H015604 / 1 bis TP unterstützt /.

Materials

Plastic tubing Fisher Scientific TWT-200-061G Other tubing may be suitable however it must fit within a 1ml pipette tip.
Fine mesh Any haberdashery – Fine curtain mesh is suitable
1ml pipette tips VWR 83007-376 Various brands of pipette tips would be suitable
Plastic Vials Sarstedt 58.49 Larger vials or bottles could also be used.
Cotton Balls Lewis Medical Solutions 28170 The size of cotton will vary depending on the size of vials used
Blue Food colouring Thesugarcraftcompany – Other dye colours and brands can have variable results.
CO2 Tank BOC BOC 40VK
Sharpie Markers Steadtler Lumocolor 313 S Various colours can be used, but Lumocolor S give an excellent combination of durability and fineness
Stopwatch Salter SL3920 Any stopwatch with a good digital display would be fine
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DrosophilaMating BehaviorBehavioral AssaysFood ColoringLabelingCO2 AnesthesiaNon-invasiveSpecies Comparison

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Verspoor, R. L., Heys, C., Price, T. A. R. Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila. J. Vis. Exp. (98), e52645, doi:10.3791/52645 (2015).
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