3D organotypiques Co-culture Modèle Soutenir médullaire thymique des cellules épithéliales prolifération, la différenciation et Promiscuous Gene Expression
Summary
Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein – a modified skin organotypic culture model – has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression.
Abstract
Le développement des cellules T intra-thymique nécessite un maillage tridimensionnel complexe composé de diverses cellules stromales, à savoir, les cellules non-T. Thymocytes traversent cette échafaudage dans un ordre temporel et spatial très coordonnée en passant séquentiellement points de contrôle obligatoires, à savoir, l'engagement de la lignée de cellules T, suivie par récepteur des cellules T génération et la sélection du répertoire avant leur exportation vers la périphérie. Les deux types de cellules résident principaux formant ce échafaudage sont des cellules épithéliales thymiques corticales (CTEC) et médullaires (mTECs). Une caractéristique clé de mTECs est l'expression que l'on appelle la promiscuité de nombreux antigènes tissulaires restreint. Ces antigènes de tissus soumis à des restrictions sont présentés pour les thymocytes immatures directement ou indirectement par mTECs thymiques ou les cellules dendritiques, ce qui entraîne respectivement à une auto-tolérance.
Appropriés modèles in vitro imitant les voies de développement et les fonctions du CTEC et mTECs sont actuellement lacroi. Ce manque de modèles expérimentaux adéquats a entravé par exemple l'analyse de l'expression génique promiscuité, qui est encore mal comprise au niveau cellulaire et moléculaire. Nous avons adapté un modèle organotypique 3D co-culture à la culture ex vivo mTECs isolés. Ce modèle a été conçu à l'origine pour cultiver des kératinocytes de manière à produire un équivalent de peau in vitro. Le modèle 3D conservé des caractéristiques fonctionnelles clés de mTEC biologie: (i) la prolifération et la différenciation terminale des CD80 lo, Aire-négatif en CD80 salut, Aire-positif mTECs, (ii) la réactivité de RANKL, et (iii) l'expression soutenue de Foxn1, Aire et les gènes de tissus restreinte dans CD80 mTECs hi.
Introduction
Thymocytes en voie de développement représentent environ 98% du thymus, tandis que les 2% restants se compose d'une variété de cellules qui composent collectivement le stroma thymique (c.-à cellules epitheliales, les cellules dendritiques, les macrophages, les cellules B, les fibroblastes, cellules endothéliales). Les cellules épithéliales corticales extérieures (CTEC) procurent immigration de cellules pro-T de la moelle osseuse, T lignée cellulaire induction dans les cellules multipotentes pré-T et la sélection positive de soi-CMH limités thymocytes immatures. Les cellules médullaires thymiques épithéliales internes (mTECs) sont impliqués dans l'induction de tolérance de ces thymocytes avec une haute affinité pour les complexes TCR auto-peptide / CMH soit par induction sélection négative ou leur déviation dans la lignée de cellules T régulatrices. Dans le cadre de la tolérance centrale induction, mTECs sont uniques en ce qu'ils expriment un large spectre des auto-antigènes tissulaires restreint (EMR) reflétant ainsi l'auto périphérique. Ce phénomène est appelé l'expression du gène de promiscuité (PGE)1,2.
La plupart des études actuelles sur ce type de cellule fascinante comptent sur ex vivo des cellules isolées, que divers systèmes de culture 2D à court terme invariablement entraîné la perte de PGE et des molécules régulatrices clés comme le CMH de classe II, Foxn1 et Aire dans les 2 premiers jours 3-6 . Il restait toutefois incertaine, les composants et caractéristiques de la maillage 3D intacte du thymus particuliers étaient manquantes dans les modèles 2D. La culture d'organe thymique ré-agrégation (RTOC) a été jusqu'à présent le seul système 3D qui permet l'étude du développement des lymphocytes T, d'une part, et de la biologie des cellules stromales, d'autre part, dans un microenvironnement thymique intacte 7. Cependant, RTOCs ont certaines limites, à savoir, ils contiennent déjà un mélange complexe de cellules, exiger l'entrée de cellules stromales fœtales et supporter une période de culture maximal de 5 à 10 jours.
Le manque de réductionniste dans les systèmes de culture in vitro a entravé l'étude deplusieurs aspects du développement des cellules T et thymique organogenèse pas moins la régulation moléculaire de pGE et sa relation à la biologie du développement de mTECs.
En raison de la proximité-apparentement de l'organisation structurée des cellules épithéliales de la peau et du thymus, nous avons opté pour un système 3D culture organotypique (OTC) qui avait été développé à l'origine pour émuler la différenciation des kératinocytes in vitro et donc de créer un équivalent dermique. Le système se compose d'un OTC matrice inerte recouvert d'échafaudage avec des fibroblastes dermiques qui sont piégés dans un gel de fibrine, sur lequel les kératinocytes sont ensemencés 8,9. Ici, nous avons remplacé les kératinocytes avec mTECs purifiés. Tout en gardant les caractéristiques de base de ce modèle, nous avons optimisé certains paramètres.
Dans le modèle de gré à gré adoptée mTECs proliféré, a subi une différenciation terminale et maintenu identité mTEC et PGE, imitant ainsi étroitement vivo développement des mTECs dans <sup> 10. Cette note technique fournit un protocole détaillé permettant la mise en place progressive d'OTC thymus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Parallèlement RTOCs, l'OTC 3D ont été de loin supérieur en termes de différenciation des TEC et pGE entretien / induction (tableau 1) par rapport aux autres (i) «cultures 3D simplifiées 'aide – fibroblastes seul, sans l'échafaud; (Ii) les systèmes 2D utilisant – cellules fibroblastes / nourricier co-cultivées avec les TEC 10, (iii) les cellules 3T3-J2 dans laquelle clones TEC développent, mais pGE est perdu, (iv) matrigel ou (v) les composants de l'ECM (données non…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been supported by the German Cancer Research Center (DKFZ), the EU-consortium “Tolerage”, the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 938) and the Landesstiftung Baden-Württemberg.
Materials
| Pregnant C57BL/6 mice | Charles River WIGA | ||
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| CD45 Microbeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Anti-PE Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Streptavidin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| EpCAM (G8.8 -Alexa 647 and -biotin) | Ref. 12 | ||
| CD80-PE antibody | BD Pharmingen | 553769 | |
| CD45-PerCP antibody | BD Pharmingen | 557235 | |
| Ly51-FITC antibody | BD Pharmingen | 553160 | |
| CDR1-Pacific Blue | Ref. 15 | ||
| Keratin 14 antibody | Covance | PRB-155P | |
| Vimentin antibody | Progen | GP58 | |
| Cy3-conjugated AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-165-003 | |
| Alexa 488-conjugated AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 106-546-003 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Molecular Probes (Invitrogen GmbH) | A-11008 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Invitrogen | C10339 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Flow Cytometry Assay Kit | Invitrogen | C10425 | |
| 12-well filter inserts (thincerts) | Greiner bio-one | 657631 | |
| 12-well plate | Greiner | 665180-01 | |
| Jettex 2005/45 | ORSA, Giorla Minore, Italy | ||
| Fibrinogen TISSUECOL-Kit Immuno | Baxter | ||
| Thrombin TISSUECOL-Kit Immuno | Baxter | ||
| PBS | Serva | 47302.03 | |
| DMEM | Lonza | BE12-604F | |
| DMEM/F12 | Lonza | BE12-719F | |
| HEPES | Gibco | 15630-049 | |
| FBS Gold | GE Healthcare | A11-151 | |
| Aprotinin (Trasylol) | Bayer | 4032037 | |
| Cholera toxin | Biomol | G117 | |
| Hydrocortisone | Seromed (Biochrom) | K3520 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | A4034 | |
| TGF-ß1 | Invitrogen | PHG9214 | |
| RANKL | R&D systems | 462-TR-010 | |
| Thermolysin | Sigma Aldrich | T-7902 | |
| OCT Compound | TissueTek | 4583 | |
| Trizol (aka. Denaturing solution – Acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction) | Invitrogen | 10296028 | |
| FastPrep FP120 | Thermo Scientific | ||
| Collagenase Type IV | CellSystems | LS004189 | 0.2 mg/ml and 57U/ml final conc. |
| Neutrale Protease (Dispase) | CellSystems | LS002104 | 0.2 mg/ml and 1.2U/ml final conc. |
| DNase I | Roche | 11 284 932 001 | 25 µg/ml final conc. |
Riferimenti
- Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self. Nat Immunol. 2, 1032-1039 (2001).
- Kyewski, B., Klein, L. A central role for central tolerance. Annual review of immunology. 24, 571-606 (2006).
- Bonfanti, P., et al. Microenvironmental reprogramming of thymic epithelial cells to skin multipotent stem cells. Nature. 466, 978-982 (2010).
- Kont, V., et al. Modulation of Aire regulates the expression of tissue-restricted antigens. Molecular Immunology. 45, 25-33 (2008).
- Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development. J Immunol. 176, 730-734 (2006).
- Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones. Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).
- White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. Reaggregate thymus cultures. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2008).
- Stark, H. J., et al. Epidermal homeostasis in long-term scaffold-enforced skin equivalents. J Investig Dermatol Symp Proc. 11, 93-105 (2006).
- Boehnke, K., et al. Effects of fibroblasts and microenvironment on epidermal regeneration and tissue function in long-term skin equivalents. Eur J Cell Biol. 86, 731-746 (2007).
- Pinto, S., et al. An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression. J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).
- Gabler, J., Arnold, J., Kyewski, B. Promiscuous gene expression and the developmental dynamics of medullary thymic epithelial cells. Eur J Immunol. 37, 3363-3372 (2007).
- Farr, A., Nelson, A., Truex, J., Hosier, S. Epithelial heterogeneity in the murine thymus: a cell surface glycoprotein expressed by subcapsular and medullary epithelium. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 645-653 (1991).
- Stark, H. J., et al. Authentic fibroblast matrix in dermal equivalents normalises epidermal histogenesis and dermoepidermal junction in organotypic co-culture. Eur J Cell Biol. 83, 631-645 (2004).
- Schoop, V. M., Mirancea, N., Fusenig, N. E. Epidermal organization and differentiation of HaCaT keratinocytes in organotypic coculture with human dermal fibroblasts. J Invest Dermatol. 112, 343-353 (1999).
- Rouse, R. V., Bolin, L. M., Bender, J. R., Kyewski, B. A. Monoclonal antibodies reactive with subsets of mouse and human thymic epithelial cells. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 36, 1511-1517 (1988).
