正常和恶性肌细胞移植到免疫受损成年斑马鱼

所有动物的程序批准了美国马萨诸塞州总医院的小组委员会在研究动物护理，根据协议＃2011N000127。 第1节骨骼肌细胞移植到成人RAG2 E450fs纯合突变斑马鱼 1.准备的成年斑马鱼供体骨骼肌细胞获得转基因成年斑马鱼已荧光标记的肌肉。在这个实验中，30α 肌动蛋白，RFP捐赠鱼25被用来移植每个收件人鱼1×10 6个细胞。 在1.6毫克牺牲捐助斑马鱼/毫升三卡因磺酸（MS222），10分钟或直到没有动静厣是显而易见的。 将捐助鱼吸水纸巾和消费用干净的刀片背部的肌肉。切应靠近肛门以45°角最大化的组织集合（如在图1A中指出的</strong>）。放置解剖组织到一个干净的10cm培养皿。 加入500微升的悬浮缓冲液（预冷却的0.9倍磷酸盐缓冲盐水（PBS），补充了5％胎牛血清（FBS））向解剖组织。最多10个捐助国斑马鱼可以放在一起本卷。 讳言用刀片将组织> 20次，直到细胞在均匀的悬浮液。整个背部肌肉均匀化，包括皮肤，骨骼和鳍。加入2毫升悬浮缓冲液。使用5毫升吸管，磨碎的细胞悬液≥20倍以解离细胞。 过滤通过40微米的筛网过滤器的细胞悬浮到50ml锥形管置于冰上。 用额外的2.5毫升悬浮缓冲液洗培养皿以收集剩余的组织，并通过同样的过滤器和锥形管过滤，以5毫升（10施主鱼可以每分离物被使用）的最终体积。 注意：皮肤，骨骼和鳍将过滤后排除。 </li> 如果适用的话，结合相似悬浮到相同的锥形管中。 算使用台盼蓝染料与血球存活细胞的总数。 保留500μl的流式细胞术，如果需要的话（可选的，步骤2）。 离心细胞悬浮液在1000×g离心，10分钟，在4℃下。 弃上清，悬浮细胞在3.33×10 5个细胞/μL（0.9X PBS + 5％FBS）。总共，3微升将每个收件人鱼注射总共每个收件人1×10 6个细胞（第3步）的。 注：小于3微升细胞悬浮液应该被移植到受体鱼。如果细胞数被限制，因为低达5×10 4个细胞每收件人可导致成功植入（ 表1）。 供体骨骼肌细胞的制备2.流式细胞仪分析（选配） 从野生型 ，非转基因鱼隔离概述我的肌肉n步1.1。该样品用作阴性对照，是用于设定流式细胞计数门是有用的。 添加适当的生存能力染料。例如，添加5微升股票DAPI溶液（500毫微克/微升），以500微升肌肉的准备。涡稍微之前的分析。获得5×10 3〜1×10 4个事件。首先分析野生型对照样品放在门后面的肌肉细胞转基因鱼孤立的分析。 通常在1小时内的肌肉组织解剖后，在这段时间内解剖细胞保留超过60％的存活率（ 图2）进行的流式细胞术分析：注。细胞应保持在冰上在任何时候。使用台盼蓝染料与血球总细胞生存力可以被重新评估移植前。 3.肌内移植骨骼肌细胞变成成年RAG2纯合突变斑马鱼清洁10μ;升26S G微型注射器通过拉伸并排出10％的漂白剂溶液（5次），然后用70％乙醇（5次），然后接着悬浮缓冲液（0.9X PBS + 5％FBS，10次）。 通过加入单滴三卡因甲磺酸盐（MS222，4毫克/毫升储液）到含有在体系水中的鱼，直到厣动作缓慢培养皿麻醉2-4月龄纯合RAG2突变鱼或野生型接受者鱼（作为对照）和鱼类都还在。 注：三卡因麻醉剂量将取决于接受者的年龄斑马鱼和大小。 将麻醉收件人斑马鱼的湿纸巾或海绵，用左手面朝上。 将注射器针头插入latero-背侧肌肉（参考图1A）。确保注射以45°角进行的。注射3微升每鱼的细胞悬浮液（在步骤1.12中制备）的总计每个收件人1×10 6个细胞。小心用塑料勺子恢复注入斑马鱼转移到一个干净的坦克。 通过在亮场和荧光显微镜成像麻醉鱼评估收件人斑马鱼为植入率在10，20，30天后移植。 第二节胚胎性横纹肌肉瘤（ERMS）移植到成人纯合子突变RAG2斑马鱼斑马鱼胚胎的DNA 4.显微注射通过消化10微克的DNA用XhoI的，在37℃下进行6小时或O / N线性化RAG2-KRASG12D质粒7。 纯化的DNA通过标准的苯酚：氯仿萃取和用乙醇沉淀。重悬在20μl去离子水（替代地，商业的DNA片段纯化柱可以使用）。 运行在1％琼脂糖凝胶未消化和消化的DNA，并确定DNA的b的浓度Ÿ光谱仪的读数。 1，1：：另外，在1运行样品5和1:10的稀释液在1％琼脂糖凝胶和量化相比的DNA梯。 制备的注射混合在15毫微克/微升消化的RAG2-KRASG12D的DNA在0.1M KCl和0.5倍的Tris-EDTA的最终浓度。在2 NL注射体积中喷射出的最终的DNA量将是30页。 注：最多三个不同的DNA构建体可以有效地共注射在最高60皮克每胚胎的DNA。这些转基因被整合到基因组中，并共表达内显影肿瘤26。 注入线性RAG2-KRASG12D成单细胞阶段的胚胎基本上如27到感兴趣的斑马鱼品系（ 图1B）。注射应在细胞而不是为了更高的效率来执行在蛋黄。在该实验中，双转基因AB-应变; Myf5的-GFP，mylpfa-mCherry使用。使用标准的饲养P提高斑马鱼rotocols 28。 注：注塑生存通常取决于所用的斑马鱼品系。平均来说，注射的胚胎的30％将发展ERMS。 300-600胚胎应每个实验，以确保用于移植和分析所产生的足够的GFP阳性和mCherry阳性原发性肿瘤注射。 5.筛选斑马鱼幼虫主要ERMS 观察注入斑马鱼从10至30天注射后对外部可见主ERMS的出现。 30天注射后，通过加入单滴三卡因甲磺酸酯（MS222 4毫克/毫升储液）到含有鱼系统水直到厣动作缓慢和鱼仍培养皿麻醉收件人斑马鱼。 注：三卡因麻醉剂量将取决于接受者的斑马鱼的年龄和大小。原发性肿瘤的斑马鱼需要较低剂量的三卡因的。 选择初级ERMS轴承鱼类，Myf5的-GFP阳性和mylpfa-mCherry阳性，用落射荧光显微镜。 6. ERMS肿瘤准备牺牲选定的主ERMS轴承斑马鱼在1.6毫克/毫升三卡因磺酸（MS222），10分钟或直到没有动静厣是显而易见的。 分别处理每个荷瘤斑马鱼。在一个干净的培养皿中放置的鱼和解剖周围用刀片和细镊子（ 如图1B）的肿瘤。传送解剖肿瘤组织到一个干净的培养皿中。 加入100微升预冷的0.9倍磷酸盐缓冲盐水（PBS）的补充有5％胎牛血清（FBS）。剁碎的组织用干净的刀片> 20次，直到细胞在均匀的悬浮液。 添加900微升的相同缓冲液（0.9X PBS + 5％FBS）中，移液管上下数次以解离应用1000微升过滤移液管尖的细胞。经过40过滤器＃956;米滤网成相应的50ml锥形管中。储存在冰。 与一个附加的2-4毫升缓冲液洗培养皿，并经过相同的目滤网并进入相应的锥形管中。 离心机在1000×g离心，10分钟，在4℃下。 弃上清，重悬在100微升缓冲。 算使用台盼蓝染料与血球存活细胞的总数。 稀释细胞至所需的浓度，在同样的缓冲液（0.9X PBS + 5％FBS）中。细胞应稀释至5×10 3个细胞/微升移栽每个收件人斑马鱼5微升在总共每个收件人2.5×10 4个细胞。 流式细胞计数分析也可以用少量的从步骤6.5的悬浮液，以量化样品中的荧光细胞的相对比例进行。 注：除了100微升细胞悬液（以下步骤3.5过滤）的设置和稀释400微升的0.9倍PBS + 5％FBS停牌流式细胞分析缓冲区。为了确保正确的门，用单一的转基因肿瘤组织或肌肉成年野生型，Myf5的-GFP和mylpfa-mCherry鱼隔离进行进一步的分析。在第1节的第2步进行描述流式细胞本质。 7. ERMS移植到成人RAG2纯合突变斑马鱼通过绘制在与排出10％的漂白剂溶液（5次），然后用70％乙醇（5次）清洗一个10微升26S G微型注射器，然后接着悬浮缓冲液（0.9X PBS + 5％FBS中的10倍）。 通过加入单滴三卡因甲磺酸酯（MS222 4毫克/毫升储液）的入水体系含有鱼直到厣动作缓慢和鱼仍培养皿麻醉收件人纯合RAG2突变鱼。 放置麻醉收件人斑马鱼上的湿纸巾或SPONGE，与腹朝上。 注入5微升细胞悬浮液进入腹膜腔（每个收件人2.5×10 4个细胞）。 注：注射针应不同肿瘤注射之间如在步骤4.1中所述进行清洁。 5到10微升可以有效地移植腹膜内，这取决于接受者的鱼的大小。肿瘤植入可通过注入1×10 4〜5×10 5个未分类的细胞每收件人鱼（ 表1）来实现。 小心地将收件人斑马鱼放入干净的罐用塑料勺。 通过在亮场和荧光显微镜成像麻醉鱼评估收件人斑马鱼为植入率在10，20，30天后移植。 利用植入鱼下游应用，包括荧光活化细胞分选（FACS）来评估分化状态（ 图3H），标准组织ANALYSIS（ 图3F），成像治疗响应15，和/或串行移植方法包括有限稀释分析11。