이미징 CA<sup> 2 +</sup마우스 망막의 광 수용체 콘 축삭 터미널에서> 역학

모든 동물의 절차는 독일 연방 정부에 의해 결정과 튀빙겐 대학의 기관 동물 복지위원회에 의해 승인 된 동물 보호를위한 가이드 라인과 법률을 준수 수행 하였다. 1. 동물 모델 HR2.1 : TN-XL 칼슘 바이오 센서 마우스 형질 전환 HR2.1을 사용 TN-XL 마우스 라인은 원뿔 광 수용체 (10)에 선택적으로 칼슘 바이오 센서 TN-XL을 표현. 표준 12 시간 주 / 야간 리듬 제기 중 섹스의 6 주 오래 된 마우스 – 3을 사용합니다. 2. 망막 해부 생리 솔루션 125 mM의 염화나트륨, 2.5 mM의 KCl을, 1 mM의의 MgCl 2, 1.25 mM의의 NaH 2 PO 4, 26 mM의 NaHCO3를 0.5 mM의 L- 글루타민, 20 mM의 (+) 포도당을 함유 세포 외 용액 갓 2 L를 준비한다. 모든 성분이 용해 될 때까지 섞는다. "버블"세포 외 솔루션10 분 – 5 carboxygen (95 % O 2, 5 % CO 2)와. 2 mm의 농도에 도달하기 위해 염화칼슘 (2)를 추가합니다. 세포 외 솔루션을 버블 링 한 후, 그 산도를 측정한다. pH는 그렇지 않으면 실수 용액의 제조 동안되었을 가능성이 7.4이어야한다. 상수의 pH를 확인하기 위해 실험을하는 동안 버블 링 속도 및 솔루션 온도를 일정하게 유지. 2 플라스크, 망막 박리 다른 하나는 녹화 설정 (관류)에 대한 하나에 주식을 분리합니다. 눈의 안구 적출술과 망막의 분리 (5-10 분) 핵의 제거를위한 작업 영역에서 희미한 붉은 조명을 유지한다. 해부시 콘의 백화를 방지하는 650 나노 미터 (또는 그 이상)의 피크 파장과 LED를 사용한다. 콘 완전히 녹음시 증감되도록 통풍이 잘되는, 차광판 상자에 새장을 넣어 2 시간 동안 마우스를 어두운 적응. laborato에서 마우스를 마취기화기 및 표준 마우스 케이지를 보유하고 기밀 용기를 사용하여 이소 플루 란 (5 %)와 공예 후드. 기화기를 다룰 때 조심스럽게 제조자의 지시 사항을 따르십시오. 알레르기 항원에 대한 노출을 줄이기 위해 장갑과 얼굴에 마스크를 사용하십시오. 해부에 대한 40 배 확대 – 10 쌍안 현미경을 사용합니다. 잘린 마취 마우스를 희생. 방향은, 방수 펜으로 각각의 눈 (= 지느러미)의 상단을 표시합니다. 왼쪽 또는 오른쪽 눈을 사용할지 여부에 대한 추적합니다. 안구 뒤쪽 시신경을 절단하여 신중하게 곡선 가위를 사용하여 눈을 제거합니다. 해부 갓 carboxygenated 세포 외 용액을 함유하는 페트리 접시에 안구 옮긴다. 안구를 전송, 시신경 그루터기를 잡고. 날카로운 주사 바늘로 각막과 (오라 참나무에서 예) 공막 사이의 경계를 따라 모든 지점에서 눈을 관통. 전자를 잡고부드럽게 포셉 한 쌍의와 공막에 너희가 하나 가위 이전 단계에서 만든 구멍에 블레이드 삽입합니다. 후방 부 (아이 컵)에서 눈 (각막, 렌즈, 유리체)의 앞쪽 부분을 분리 오라 세라 따라 절단. 망막에 지느러미의 위치를​​ 표시 할 수있는 펜 마크의 위치에서 (시신경 유두를 향해) 반경 방향으로 아이 컵을 잘라. 참고 :이 방법을 준비, eyecups은 나중에 사용하기 위해 지속적으로 carboxygenated 용액에서 유지 될 수있다. 지느러미가 떨어져 자신의 포인트를 삭감하도록 페트리 접시에 아이 컵을 돌립니다. 망막과 공막 사이에 겸자를 삽입하여 팁 왼쪽 집게 각 쌍 세안 컵의 우측 공막을 잡아. 부드럽게 아이 컵의 공막 부분을 반전시켜 망막을 분리합니다. 마지막으로, 공막의 망막을 무료로 가위를 해부 마이크로를 사용하여 시신경을 잘라. 참고 :이 중요한 단계입니다. 망막 (예에 의한 손상을 방지감동과) 집게로를 압박. 집게 한 쌍의 제 2를 사용하여 망막 표면으로부터 부스러기 및 유리체를 제거 부드럽게 포셉 쌍 망막의 가장자리 중 하나를 잡고. 망막 표면이 깨끗하면, 세 개의 추가 단축, 반경 컷 (약마다 90 °)를 만들기 위해 가위를 해부 마이크로를 사용합니다. 이 상처는 하나주의 깊게 광 수용체 측이 페트리 접시 (그림 1A)에서 아래로 향하게하여 망막을 평평하게 할 수 있습니다. 슬라이스 준비 (10-15 분) 슬라이스를 장착하고, 기록 챔버로 전달하기위한 망막 슬라이싱과 유리 커버 슬립에 대한 미리 니트로 셀룰로스 멤브레인 필터를 준비한다. 가위를 사용하여 약 10 × 5mm 크기의 사각형 조각으로 니트로 셀룰로오스 필터 멤브레인을 잘라. glasscutter를 사용하여 약 10 × 5mm 크기의 사각형 조각으로 된 커버를 잘라. 천천히 가까운 세포 외 용액에 유리 슬라이드를 담가조직. 부드럽게, 포셉 한 쌍을 사용하여 매우 가장자리를 잡아 신경절 세포 쪽을 위로해서 유리 슬라이드에 망막을 잡아 당깁니다. 이 과정은 기계적 손상과 조직의 폴딩을 줄일 수 있습니다. 각각의 연구 문제와 관련된 망막의 지역을 선택 (또한 토론 참조). 단계 2.2.9에서 만든 긴 컷 등의 망막 반 (그림 1A)를 표시, 기억하십시오. 곡선 메스 블레이드를 사용하여 선택한 망막 지역에서 직사각형, 약 1 × 2mm 크기의 조각을 잘라. 조직 주변의 과잉 솔루션을 닦아. 신경절 세포 측이 멤브레인에 부착되도록 망막 조각 위에 여과막을 놓는다. 즉시 단단히 막 조직을 연결하는 막에 세포 외 매체의 드롭을 추가합니다. 신선한 세포를 함유하는 용액 슬라이싱 챔버 막 장착 망막 조직을 옮긴다. 200 μm의 수직 조각으로 망막을 잘라조직 초퍼 (23)에 부착 된 신선한 면도날을 이용하여 두께 (도 1b). 모든 망막 조각에 대한 블레이드를 변경합니다. 주 : 면도날에 의해 지시 된 바와 같이 전체 박막이 동시에 분할되도록 완벽 슬라이싱 실 바닥면과 정렬 될 필요가 절단시 소리 "클릭"- 그렇지 블레이드 구부릴 수 있으며, 슬라이스를 손상. 막에 높은 진공 그리스를 적용하여 유리 커버 슬립에 하나의 막에 장착 된 조각을 접착제 만 (그림 1C)를 종료합니다. 그리스에서 무료로 망막 아래의 유리 표면을 유지합니다. 유지 챔버 내의 세포 외 용액의 방울에 의해 덮여 커버 슬립 장착 슬라이스 유지 – 예 닫히고 광성 용기, 알루미늄 호일로 덮여 뚜껑 페트리 접시 – RT에서 carboxygen 대기하에. 유지에 분위기를 유지하기 위해 작은 물 탱크 버블 링에 의해 carboxygen 소개챔버는 가습; 이 마르지 슬라이스를 방지 할 수 있습니다. 기록 챔버에 (하나 하나)으로 이동하기 전에 15 분 – 슬라이스 10 홀딩 챔버 휴식을 허용. 조각 실온에서 유지 실에 4 ~ 5 시간까지 유지 될 수있다 (~ 21 ° C). 3. 두 광자 칼슘 이미징 이광자 현미경 가동 목표 현미경 (MOM) 타입 두 광자 현미경을 사용합니다. 세부 항목 모두 MOM 디자인 및 이미징 절차는, 이전 24 설명했다 10,21,25 (소스와 기업, 표 1 참조). 참고 : 사용할 수 다음 최소 요구 사항을 만족 상관 직립 이광자 현미경 : 그것은 ~ 860 nm의 조정 가능한 (a) 펄스 레이저, (b)는 두 개의 동시 취득한 형광 채널의 최소, (c 구비되어야 )) eCFP과 황수정 형광, (D 필터광 자극기 (가능한 설계를 위해 24, 26 참조), 충분한 프레임 속도로 시간 경과 이미지 시퀀스를 기록 허용 (E) 소프트웨어 칼슘에게 관심 2+ 신호를 해결한다. 제조자에 의해 지시 된 바와 같이 두 광자 이미징 시스템을 시작합니다. 엄밀히 시설의 레이저 안전 지침을 따르십시오. ~ 860 nm의 레이저 및 조정을 시작합니다. 기록 챔버로 유지 실에서 슬라이스를 전송하고 즉시 carboxygenated 세포 외 용액으로 관류 시작. 2 ml / 분의 관류 유량 기록 챔버 37 ° C의 온도를 유지한다. 20X 0.95 NA 침수 목표를 사용합니다. 가능한 경우, 망막 슬라이스 (도 2)의 위치를 기록 챔버 아래 LED 적외선과 결합 된 CCD 카메라를 사용한다. 그렇지 않으면 두 광자 이미징 (3.1.5 참조)을 사용하여 슬라이스를 찾습니다. 바이오 센서의 표현을 볼 두 광자 영상으로 전환합니다. 켜다eCFP과 황수정의 형광 이미징을위한 두 개의 감지 채널. 스캔하고 (도 3a)를 기록하기위한 콘 단자의 행을 선택하는 이광자 현미경을 제어하는 화상 취득 소프트웨어를 사용한다. 128 × 16 픽셀 이미지 (31.25 Hz에서) 또는 유사한 구성으로 설정 이미지 수집. 외부 세그먼트에서 photopigments의 표백을 방지하기 위해 콘 단자에 스캔 영역을 제한합니다. 참고 : (칼슘 바인딩 해제 2 + 바인딩 CA의 τ = ~ 0.6 초 2+, τ = ~ 0.2 초 16 참조) TN-XL 칼슘 센서 ~ 8 Hz의 최소 프레임 속도를 권장합니다. 빛 자극 기록 다른 10,21,26 바와 같이 다음과 같은 단계들을 수행하도록 보조 스테이지 전체 장광 자극기를 사용한다. 참고 : 전체 필드 광 자극에 대한 간단한 솔루션은 두 밴드 필터링 패스 LED를 (: 360 BP (12), "녹색": 578 BP (10) 예를 들어, "파란색")를 사용하는 것입니다즉, 마우스의 콘 파장 감도 일치하지만, 동시에 형광 검출에 사용되는 필터와 오버랩하지 않는 (CF. 3.2.4). 의 LED로부터 광 기록 챔버 (도 2)의 저부를 통해 응축기에 의해 집광된다. 이 자극기 디자인, 그것의 교정에 대한 자세한 내용은 빛의 강도는 사용 유발 된 콘 사진 이성체의 비율은, 10,21,26를 참조하십시오. 빛의 자극을 (3.2.3 참조) 제시 또는 약리 에이전트를 적용하기 전에 – (또한 잠재적 인 함정을 참조, 30 초 20) 레이저를 켜고 콘 스캐닝 레이저 자극 배경 빛에 적응 할 수 있습니다. (그림 3B, C와 같이 빛의 예를 들면, 플래시,) 임의의 자극의 프레 젠 테이션을 시작합니다. 단계 3.2.1에서 설명 자극기의 경우에, 사용자 정의 된 소프트웨어에 의해 제어되는 마이크로 프로세서 보드 (대를 사용하여 시간에 걸쳐 두 개의 LED의 세기를 변조함으로써 생성 자극자세한 내용은) 10,21,26를 참조하십시오. 두 형광 채널을 녹화 시작 (. 예를 들어, "블루"무서워 – 기증자 eCFP에 대한 483 nm에서와 "노란색"무서워 – 수용체에 대한 535 nm에서, 사양은 표 1 참조)를 동시에 각각의 이미지 수집 소프트웨어를 사용하여 (또한 3.1 참조 .6). 예를 들어, 표시등이 깜박입니다 (그림 3B, C), 기록 최소 8의 경우 – 10 자극 프리젠 테이션 (시험). "에서 슬라이스"칼슘 교정 기록 칼슘 (3.4에서 설명) (3.1.6과 3.2.4에 설명 된대로)와 콘 세트의 기본 칼슘 수준을 추출 콘 단자에 2 + 신호. 5 μm의의 (DMSO에 용해) 이오 노마 이신과 10 mM의 EGTA와 "칼슘 2 + 무료"세포 외 매체로 전환 (또는, 대안 BAPTA)을 첨가. 녹음 콘 단자는 다시 매 5 분 최소 형광 비율 (R 최소)을 결정, <할EM> 즉, 세포 내 칼슘의 (근처) 부재의 비율 2+. 30 분 -이 어디 (15) 사이에 걸릴 수 있습니다. 참고 : 관류 시스템은 다른 저수지 사이를 전환 할 수 있도록 할 필요가있다. (DMSO에 용해) 5 μM의 이오 노마 이신 2.5 mM의 칼슘과 세포 외 매체로 전환합니다. 5 분의 배양 시간 후에 기록 콘은 다시 5 분마다, 즉 최대 형광 비율 (R 최대), 내 Ca 2 + 농도의 포화의 존재 비율을 측정 하였다. 안정되고 칼슘 비율 15 분 – 이오 노마 이신 응용 프로그램에 따라, 그것은 3 사이에 걸릴 수 있습니다. 참고 : 2 + 높은 칼슘에 조각을 노출하고 결국 세포가 손상 될 수 긴 기간 동안 이오 노마 이신. 정상적인 형태를 유지 분석 만 셀을 포함합니다. 농도 (즉, EGTA, 이오 노마 이신)를 적용 할 필요가있다. 칼슘 교정에 대한 자세한 내용은프로토콜, 13, 17을 참조하십시오. 데이터 분석 주 : 각 현미경 소프트웨어와 호환 커스텀 분석 스크립트를 실행할 수있는 화상 처리 및 데이터 분석 소프트웨어 패키지를 사용한다. 영상 데이터 파일을로드하고 각 콘 단자 (그림 3A) 주변의 관심 (로아)의 영역을 그립니다. ROI 내의 각각의 프레임의 평균 형광 강도 및 FRET – 억 셉터 (황)와 도너 (ECFP)로 이루어지는 군으로부터 선택 형광 (R = F / F D;도 3B, C) ​​사이의 비율 (R)을 계산하기 전에, 배경 형광을 뺄. 이 비율은 일반적으로 상대 세포 내 칼슘 농도에 대한 프록시로서 사용되지만, 교정 (3.3) 후에, 또한 절대 농도 (3.4.3 참조)를 추정 할 수있다. 주 : 척추 경이 얼기 외측 층에서의 위치를​​ 인식 할 수 있고, 그 형태는 (약간 작은 원뿔보다 "블롭을"평탄화인 somata) 콘 축삭의 끝 부분에 위치. 평균 자극 시험 (그림 4A). 응답 크기에 대한 대책과 곡선 (R)에서 빛 자극, 피크 진폭 (R 앰프) 및 지역 이전 등 칼슘 기준 레벨 (R 기준)으로 평균 흔적 (그림 4B)에서 응답 매개 변수를 추출합니다. 또한, 이러한 응답 상승 (T 상승)과 감쇠 시간 (T 붕괴)로 평균 추적에서 반응 속도론을 추출 (20 % 및 R 앰프의 80 % 사이 = 각각의 시간 간격도 4B 그림 참조). 이러한 매개 변수를 확인하는 방법에 대한 자세한 내용은 10를 참조하십시오. 3.3.1-3.3.3 단계에서 측정에 기초하여 절대 콘 칼슘 농도의 추정을 계산한다. 최소 및 최대 칼슘 이온 농도, R 최소 및 R 최대 캘리포니아, 각각 기증자 형광의 비율을 사용 2+ </s> -bound (F D, 칼슘이 결합 된) 및 -unbound까지 (F D, 칼슘이없는) 상태뿐만 아니라 생체 내 해리 상수는 다음과 TN-XL에 대한 (K D는 = 0.77, 16 참조) 식 (27 아날로그) :