Два-Фотон изображений клеточной динамики в спинном мозге мыши

Мышиные модели демиелинизации, в том числе экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭОС) и внутричерепной инфекции вирусом neuroadapted мыши гепатит (MHV), являются отличными инструментами для изучения молекулярных путей и клеточные взаимодействия, связанные с болезнью. Они привели к и поддерживается эффективность FDA одобрило фармацевтических методов лечения, в основном, для прекращения аутоиммунных и воспалительных ^1. Однако, как только эндогенного ремиелинизация не удалось, утвержденные в настоящее время терапия не могут эффективно ремонтировать демиелинизированные поражений в центральной нервной системе. Таким образом, ремонт ориентированных методов лечения на этой стадии заболевания имеют решающее значение для облегчения хронических симптомов и улучшения качества жизни. В последнее время нейронные клетки-предшественники (НПК) пришли на первый план в качестве потенциального регенеративного метода лечения на проблемные участки воспаления и демиелинизации. Несколько исследований выявили способность NPC, чтобы вызвать endogenoнам ремиелинизации и непосредственно участвовать в ремиелинизации ^2-8. Потому что НПС участвуют в непосредственном ремиелинизации, необходимо, чтобы понять их кинетики и взаимодействия с эндогенными клеток после трансплантации. После трансплантации НПС мигрируют вентрально в районы белого повреждений материи, то рострально и каудально по отношению к месту пересадки ^5,9. Кинетика миграции отличаются в ответ на сигналы окружающей среды; НПС пересаженные в неповрежденных спинного мозга имеют больше скорости, чем NPC, пересаженных в поврежденный спинной мозг ^6. После миграционный период, переданы НПС размножаться широко, по более высокой ставке в поврежденном спинном мозге по сравнению с интактной спинного мозга ^6. И, наконец, большинство НПС дифференцироваться в олигодендроциты и инициировать прямой ремиелинизацию ^4,6,9.

Демиелинизированные поражение является сложным и может включать в себя разнообразную популяцию клеток на различных стадияхctivation. Например, активный рассеянный склероз (MS), поражение может включать значительное население активированных Т-клеток микроглии, M1 и M1 макрофагов, а хроническое повреждение молчание МС может состоять в основном из реактивных астроцитов с несколько воспалительных клеток ^10-13. Из-за разнообразия эффекторных клеток, два фотона (2P) изображений в мышиных моделях демиелинизации является чрезвычайно полезным инструментом, чтобы помочь понять местные клеточные взаимодействия внутри поражения. В MS и многих широко используемых моделей MS-исследовательских, большинство поражений расположены на брюшной стороне спинного мозга, области недоступны для визуализации прижизненный 2P-за глубины поражения и высоким содержанием липидов в спинном мозге. Чтобы обойти эти проблемы и исследование межклеточных взаимодействий в рамках поражений вдоль вентральной спинного мозга мы разработали простой экс естественных 2P подготовки изображений ^6.

Это исследование является продолжением предыдущей публикации методы, которые показалиПроцедура пересадки усиленный зеленый флуоресцирующий белок (EGFP), экспрессирующие НПС в спинном мозге мышей после JHMV штамма MHV-индуцированной демиелинизации ^14. Пять недельных мышей, инфицированных JHMV и пересадить с EGFP-NPC, на грудном уровне 9 на 14 день после заражения. Протокол, представленные здесь приведены подробные шаги на том, как извлечь спинной мозг, сделать Экс Vivo агарозном подготовку и изображения пересадить EGFP-NPC взаимодействия с повышенной желтого флуоресцентного белка (EYFP) экспрессирующие аксонов. Мыши, экспрессирующие EYFP под нейронов конкретных Thy1 промотора были использованы в этой процедуре ^15. Только некоторые из аксонов выразить EYFP, что делает его полезным для работы с изображениями отдельных аксонов. Здесь мы показываем, спинного мозга удалены через 7 дней после трансплантации; Однако, спинной мозг может быть извлечена в любой момент времени после трансплантации. В то время как показано взаимодействие НПС с поврежденных аксонов, наш протокол может быть использован в сочетании с генетическими флуоресцентных маркеровдругих типов клеток, чтобы исследовать множество клеточных взаимодействий, происходящих во всем спинного мозга мыши.