Summary

Design, ytbehandling, Cellular Plating och Odling av Modular neurala nätverk bestående av Funktionellt Inter-anslutna kretsar

Published: April 15, 2015
doi:

Summary

Detta manuskript beskriver ett protokoll för att växa in vitro modulära nätverk bestående av rumsligt begränsade, funktionellt sammankopplade neuronala kretsar. Ett polymert mask används för att mönstra ett proteinskikt för att främja cellulär adhesion över odlingssubstrat. Pläterade nervceller växer på belagda områden upprättande spontana kontakter och uppvisar elektrofysiologiska aktivitet.

Abstract

Hjärnan fungerar genom samordnade aktivering och den dynamiska kommunikation av neuronala församlingar. En stor öppen fråga är hur en stor repertoar av dynamiska motiv, som ligger till grund mest skiftande hjärnfunktioner, kan växa fram ur en fast topologisk och modulär organisation av hjärnkretsar. Jämfört med in vivo-studier av neuronala kretsar som utgör inneboende experimentella svårigheter, in vitro förberedelser erbjuder en mycket större möjlighet att manipulera och sondera de strukturella, dynamiska och kemiska egenskaper experimentella neuronala system. Detta arbete beskriver ett in vitro experimentell metodik som tillåter odling av modulära nätverk som består av rumsligt distinkta, funktionellt sammankopplade neuronala församlingar. Protokollet tillåter styrning av tvådimensionella (2D) arkitektur av neuronala nätverket på olika nivåer av topologisk komplexitet.

Ett önskat nätverk mönstring kan varauppnås både på vanliga täckglas och substrat inbäddade mikroelektrod matriser. Mikrobearbetade strukturer är präglade på en kiselskiva och används för att skapa biokompatibla polymera schabloner, som inkorporerar de negativa särdragen hos den önskade nätverksarkitektur. De schabloner som är placerade på odlingssubstrat under ytbeläggningsförfarande med en molekylskikt för att främja cellulär adhesion. Efter avlägsnande av schablonerna är neuroner pläterade och de spontant omdirigeras till de belagda områdena. Genom att minska den interutrymmet avstånd, är det möjligt att erhålla antingen isolerade eller sammankopplade neuronala kretsar. För att främja cellöverlevnad, cellerna är samodlade med en stödjande neuronala nätverket som ligger vid periferin av odlingsskålen. Elektrofysiologiska och optiska inspelningar av aktiviteten av modulära nät erhålls respektive genom substrat inbäddade mikroelektrod arrayer och kalcium avbildning presenteras. Medan varje modul visar spontuttalanden, globala synkroniseringar, är förekomsten av synkronisering mellan moduler regleras av tätheten av anslutningen bland kretsarna.

Introduction

Experimentella och teoretiska bevis stöder möjligheten att hjärnan fungerar genom samordnad aktivering av cellaggregat 1-5, vilket kan betraktas som dynamiska funktionsenheter som övergående interagerar med varandra, formning och underliggande olika hjärntillstånd. Funktionell modularitet är också beroende av och i samband med den strukturella modulära organisationen av hjärnkretsarna 6,7. Hur funktion och struktur av hjärnkretsar ömsesidigt forma varandra är fortfarande en av de viktigaste öppna frågorna i neurovetenskap. För att ge en djupare förståelse av denna fråga är det viktigt att identifiera optimala experimentella ramar där det är möjligt att ta itu med, åtminstone delvis, dessa frågor. Eftersom kontrollerad manipulation av spatio-temporala dynamik neuronala nätverk i di vivo-försök är utmanande, utvecklingen av in vitro neuronala nätverk modeller är av stort intresse på grund av deras enkla accessibility, övervakning, manipulation och modellering 8,9. Under de senaste åren, in vitro teknik som stöds av avancerade substrat mönstring metoder har tillåtit att förmå neuronala nätverk för att utveckla en rad fördefinierade modulstruktur 3 och studera de funktionella egenskaperna hos nät med ålagts topologier 10. I synnerhet har metoder som nyligen använts för att organisera nätverk genom att införa fysiska begränsningar 4,11. Faktum att studera sambandet mellan struktur och funktion i neuronala nätverk samt att ge en förenklad men trolig representation av samverkande neuronala församlingar bör in vitro-system ger sammankopplade neuronala delpopulationer. Brett studerade 2D homogena neuronala kulturer inte införa några rumsliga begränsningar på självorganiserade emergent ledningar av kretsarna. Därför en möjlig strategi för att forma ett konstlat sätt sammankopplade cell församlingar är att placera olika neuronala populationer i spatially olika områden. Avståndet mellan dessa områden hindrar inte de inter församlingar anslutningar. Detta tillvägagångssätt, samtidigt som en betydande kontroll över nätverks komplexitet, har visat sig ge en rikare repertoar av synkroniseringsmodeller 6,7,12.

För att underlätta en reproducerbar odling av modulära neuronala församlingar, för att ett protokoll montera självorganisering av nätverk i neuronala kluster sammanbinds av axoner och dendriter presenteras och beskrivs. Den polymera strukturen för den fysiska begränsningen av neuronala kulturer har skapats från polydimtheylsiloxane (PDMS). PDMS är en elastomer i stor utsträckning för biomedicinska applikationer på grund av sin biokompatibilitet, öppenhet och permeabilitet för gaser 13. PDMS är beredd och undantas från mikrobearbetade SU8 2075 14,15 strukturer genom spin-beläggning en flytande PDMS på en "master" som tidigare beskrivits i Jackman et al. 16 THan uppnådde mönstrade neuronala nätverk består av sammankopplade moduler av olika storlek och de har framgångsrikt fått både täck och Micro Elektrod Arrays (MEA) 17-20. Densiteten av förbindelser mellan modulerna kan ändra funktionerna i nätverkssynkroniseringen, från en fullt synkrona nätet, typiskt av enhetliga kulturer, för att transienta tillstånd av synkronisering bland modulerna.

Protocol

Proceduren utfördes enligt NIH standarder för skötsel och användning av försöksdjur och godkändes av Tel-Aviv University Djurvård och användning kommittén (tillståndsnummer – L-14-019). 1. Beredning av instrument och PDMS Förbered rånet (Table of Materials, eller beställa skivan från ett mikrofabrikation lab), en skalpell och en pincett – behövs inte sterilisering. Gör poly-D-lysin (PDL) lösning enligt följande villkor: 4 mg / ml i 0,1…

Representative Results

En SU8-2075 mögel på en kiselskiva med en funktion tjocklek av ungefär 100 | im användes för att forma PDMS. Mönstret var sammansatt av kvadraterna av flera dimensioner, med en sidolängd och avstånd som varierar mellan 200 och 700 ^ m (Figur 1B). Storleken på torget valdes för att passa synfältet av en 10X (till öar med en sidolängd <800 nm) och en 20X objektiv (till öar med en sidolängd <400 nm). Tre parametrar, nämligen cell plätering densitet, avstånd mellan kretsar, kretsar &…

Discussion

Ett protokoll för att växa 2D modulära neuronala nätverk in vitro består av funktionellt sammankopplade kretsar beskrivs. Förfarandet bygger på mönstring en cellulär vidhäftningsskikt. Mönstring uppnås med PDMS stenciler reproducera den negativa inslag i den önskade nätverksarkitektur. PDMS stenciler definierar de områden där det cellulära klisterskiktet deponeras. När cellerna är pläterade, de spontant samlas för att de belagda öarna och själv organisera sig i aktiva sammankopplade krets…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av Europeiska Project BRIANBOW (FP7 Young Explorers skulle Författarna tacka Dr Jacopo Tessadori för värdefulla synpunkter på manuskriptet, och Silvia Chiappalone för hennes hjälp i att producera de bilder som används i videon.

Materials

PDMS, Sylgard 184 Dow Corning
Nalgene Vacuum Chamber Thermo 5305-0609
Poly-D-Lysine PDL Sigma P7886
silicone grease – SILICAID 1010  aidchim Ltd H3375
Spin Coater Laurell – Technologies Corporation WS-650-23
12 well culture plate Sigma CLS3336
5-Fluoro-2’-deoxyuridine Sigma F0503
Uridine Sigma U3003
silicone grease – SILICAID 1010  aidchim Ltd H3375
MEA1060-Inv-BC Multi Channel Systems
TC02 Multi Channel Systems
Pen Strep Biological Industries Beit Haemek 03-033-1c
B-27 Gibco 17504044
glutaMAX Gibco 35050-038
MEM Minimum Essential Medium-Eagle Biological Industries Beit Haemek 01-025-1B
Micro Electrode Arrays 4Q Multi Channel Systems 60-4QMEA1000iR-Ti-pr cleaning manual: http://www.multichannelsystems.com
silicon wafer microchem SU8-2075 Preparation protocol: www.microchem.com

Riferimenti

  1. Buzsaki, G. Neural syntax: cell assemblies, synapsembles, and readers. Neuron. 68, 362-385 (2010).
  2. Meunier, D., Lambiotte, R., Bullmore, E. T. Modular and hierarchically modular organization of brain networks. Frontiers in Neuroscience. 4, 200 (2010).
  3. Levy, O., Ziv, N. E., Marom, S. Enhancement of neural representation capacity by modular architecture in networks of cortical neurons. European Journal of Neuroscience. 35, 1753-1760 (2012).
  4. Berdondini, L., et al. A microelectrode array (MEA) integrated with clustering structures for investigating in vitro neurodynamics in confined interconnected sub-populations of neurons. Sensors and Actuators B-Chemical. 114, 530-541 (2006).
  5. Bisio, M., Bosca, A., Pasquale, V., Berdondini, L., Chiappalone, M. Emergence of bursting activity in connected neuronal sub-populations. PloS One. 9, e107400 (2014).
  6. Shein Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. Innate synchronous oscillations in freely-organized small neuronal circuits. PloS One. 5, e14443 (2010).
  7. Shein-Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. Engineered neuronal circuits: a new platform for studying the role of modular topology. Frontiers in Neuroengineering. 4, 10 (2011).
  8. Bonifazi, P., et al. In vitro large-scale experimental and theoretical studies for the realization of bi-directional brain-prostheses. Front Neural Circuits. 7, 40 (2013).
  9. Jungblut, M., Knoll, W., Thielemann, C., Pottek, M. Triangular neuronal networks on microelectrode arrays: an approach to improve the properties of low-density networks for extracellular recording. Biomedical Microdevices. 11, 1269-1278 (2009).
  10. Marconi, E., et al. Emergent functional properties of neuronal networks with controlled topology. PloS One. 7, e34648 (2012).
  11. Taylor, A. M., Jeon, N. L. Microfluidic and compartmentalized platforms for neurobiological research. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39, 185-200 (2011).
  12. Sorkin, R., et al. Compact self-wiring in cultured neural networks. J Neural Eng. 3, 95-101 (2006).
  13. Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. Characterization of polydimethylsiloxane (PDMS) properties for biomedical micro/nanosystems. Biomedical Microdevices. 7, 281-293 (2005).
  14. Campo, A. G. C. SU-8: a photoresist for high-aspect-ratio and 3D submicron lithography. Journal of Micromechanics and MicroengineeringEmail alert RSS feed. 17, 81-95 (2007).
  15. Liu, G. T. Y. Kan Y Fabrication of high-aspect-ratio microstructures using SU8 photoresist. Microsystem Technologies. 11, 343-346 (2005).
  16. Jackman, R. J., Duffy, D. C., Cherniavskaya, O., Whitesides, G. M. Using elastomeric membranes as dry resists and for dry lift-off. Langmuir. 15, 2973-2984 (1999).
  17. Pine, J. Recording action potentials from cultured neurons with extracellular microcircuit electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 2, 19-31 (1980).
  18. Gross, G. W., Rieske, E., Kreutzberg, G. W., Meyer, A. New Fixed-Array Multi-Microelectrode System Designed for Long-Term Monitoring of Extracellular Single Unit Neuronal-Activity In vitro. Neuroscience Letters. 6, 101-105 (1977).
  19. Gross, G. W., Williams, A. N., Lucas, J. H. Recording of spontaneous activity with photoetched microelectrode surfaces from mouse spinal neurons in culture. Journal of Neuroscience Methods. 5, 13-22 (1982).
  20. Thomas, C. A., Springer, P. A., Loeb, G. E., Berwald-Netter, Y., Okun, L. M. A miniature microelectrode array to monitor the bioelectric activity of cultured cells. Experimental Cell Research. 74, 61-66 (1972).
  21. Herzog, N., Shein-Idelson, M., Hanein, Y. Optical validation of in vitro extra-cellular neuronal recordings. J Neural Eng. 8, 056008 (2011).
  22. Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. Journal of Neuroscience Methods. 177, 241-249 (2009).
  23. Dworak, B. J., Wheeler, B. C. Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture. Lab Chip. 9, 404-410 (2009).
  24. Georger, J. H., et al. Coplanar Patterns of Self-Assembled Monolayers for Selective Cell-Adhesion and Outgrowth. Thin Solid Films. 210, 716-719 (1992).
  25. Torimitsu, K., Kawana, A. Selective Growth of Sensory Nerve-Fibers on Metal-Oxide Pattern in Culture. Developmental Brain Research. 51, 128-131 (1990).
  26. Branch, D. W., Corey, J. M., Weyhenmeyer, J. A., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. Microstamp patterns of biomolecules for high-resolution neuronal networks. Medical & Biological Engineering & Computing. 36, 135-141 (1998).
  27. Petrelli, A., et al. Nano-volume drop patterning for rapid on-chip neuronal connect-ability assays. Lab on a Chip. 13, 4419-4429 (2013).
  28. Boehler, M. D., Leondopulos, S. S., Wheeler, B. C., Brewer, G. J. Hippocampal networks on reliable patterned substrates. Journal of Neuroscience Methods. 203, 344-353 (2012).
check_url/it/52572?article_type=t

Play Video

Citazione di questo articolo
Kanner, S., Bisio, M., Cohen, G., Goldin, M., Tedesco, M., Hanein, Y., Ben-Jacob, E., Barzilai, A., Chiappalone, M., Bonifazi, P. Design, Surface Treatment, Cellular Plating, and Culturing of Modular Neuronal Networks Composed of Functionally Inter-connected Circuits. J. Vis. Exp. (98), e52572, doi:10.3791/52572 (2015).

View Video