뉴 클레오 캡시드 소둔 매개 전기 영동 (NAME) 분석은 HIV-1 뉴 클레오 캡시드 억제제의 신속한 식별을 할 수 있습니다
Summary
This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.
Abstract
RNA 또는 안정 삼차원 접는 접어 DNA는 항 종양 또는 바이러스 약물의 개발에 흥미있는 대상입니다. HIV-1의 경우에, 바이러스 활성의 조절에 관여하는 바이러스 성 단백질은 여러 핵산을 인식한다. 뉴 클레오 캡시드 단백질 NCp7 (NC)는 바이러스 복제 동안 여러 프로세스를 조절하는 핵심 단백질이다. NC 사실 RNA 및 DNA 및 어닐링을 용이 이차 구조를 불안정화 샤페론이다. NC의 불 활성화는 새로운 접근법 및 항 HIV 치료에 대한 흥미로운 대상이다. N은 nnealing- M은 E의 lectrophoresis ediated ucleocapsid (NAME) 분석에 의해, 타르의 머리 핀의 자형 구조와 HIV의 cTAR 요소로 열역학적으로 안정 삼차원 입체에 접어 RNA 및 DNA의 용융 및 어닐링을 억제 할 수 분자를 식별하기 위해 개발되었다 HIV-1의 뉴 클레오 캡시드 단백질. 새로운 분석은 재를 사용한다이전 라벨의 필요없이 combinant 또는 합성 단백질 및 올리고 뉴클레오티드. 결과의 분석은 통상적 인 핵산 염색 하였다 표준 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (PAGE)에 의해 달성된다. 이 연구에서보고 된 프로토콜은 핵산 유능 모두, 산의 샤페론을 전장 단백질 또는 염기성 N 말단 도메인이 결여 그 절두 버전 NAME 분석을 수행하는, 방법에 의해 NC 샤페론 활성의 억제를 평가하는 방법을 설명 인터 칼 스레딩. 또한,이 식별 NAME NC 억제제의 작용 메카니즘에 표시 추정을 획득하기 위해, 다음의 두가지 상이한 모드로 유용하게 수행 될 수있다.
Introduction
인간 면역 결핍 바이러스 1 형 (HIV-1)의 뉴 클레오 캡시드 단백질 NCp7 (NC)는 역전사 동안 보조 인자로서 바이러스 복제에 중요한 역할을 단단히 성숙한 감염성 바이러스 게놈 RNA와 관련된 작은 염기성 단백질을 인 게놈 인식, 및 포장. 1-3 NC 안정한 핵산 구조체의 불안정화와 상보적인 서열의 어닐링을 촉매 핵산 샤페론 역할을한다. 양면 불안정화 활성의 징크 핑거 구조 (12-55 펩티드)에 매핑 된하면서 핵산 응집 활성은 11 개의 아미노산으로 주로 N 말단 도메인 상주. 4 양전하 단백질 어닐링 반응의 정전 장벽을 낮추고 두 개의 상보적인 서열이 함께 모여 속도를 증가시킨다.
안정된 형태로 접혀 핵산 facilitat하는 NC의 보호자 활동을 필요로즉 그들의 어닐링 5 이는 NC는 스트랜드 전송 이벤트에서 중요 역전사에서 특히 중요하다. 마이너스 가닥 전송에서 마이너스 가닥 정지 DNA가 단지 retrotranscribed, R 영역에 상보적인 서열로 옮기고 어닐링되어야 열역학적으로 선호되지만 RNA 게놈의 3 '말단에 주형. 6,이 반응으로 인해 R 영역에서 트랜스 활성화에 응답하여 영역 (TAR) RNA의 안정된 구조의 존재로 NC의 부재하에 광범위하게 발생하지 않는, 그는 그 DNA 사본 (cTAR DNA). 특성 줄기 루프 형태 7 cTAR 및 TAR은, 사실, 매우 구조화되어 지역에 연결되어 있어야합니다. NC 단백질이 머리핀을 변성하고, 상보적인 핵산 가닥 사이의 분자간 소둔 속도를 증가시킴으로써 마이너스 가닥의 전사를 촉진한다. TAR과 cTAR의 NC 소둔 메카니즘은 충분히 조사 및 드되었습니다여러 연구 논문에서 TAR 어닐링 분석으로 스크라이브 제안하는 기법은 우수한 리뷰에 도시되어있다. 8-11 요약하기는, NC는 이러한 TAR-RNA 안정적 RNA의 2 차 구조를 불안정하게 상보 시퀀스 cTAR-DNA의 2 차 구조를 불안정하게 , 결과적으로 어닐 TAR / cTAR heteroduplex를 형성 선도 RNA / DNA의 반응. 10,11 촉진 HIV 복제 중 가닥 – 전사 공정이 선호된다. 12
NC는 NC 향해 작은 분자에 의해 유도 된 간섭 가능성이 손상된 NC 활동의 결과로 바이러스 게놈의 역전사 환원 초래 보낸 새로운 항 바이러스제의 개발에 대한 매력적인 표적이다. 2,13이 접근 할 수있을 궁극적으로 성공적인 항 HIV 제의 개발로 이어질. NC 선별의 과정에서 우리는 잘 알려진 특성에 의존하는 분석을 개발 (14) 저해제효율적으로 불안정 뉴 클레오 캡시드 및 어닐링 보완 올리고 뉴클레오티드의. (10, 11) 우리는 N이 nnealing- M은 E의 lectrophoresis (NAME) 분석을 ediated ucleocapsid했다. NAME 분석은 하이브리드 TAR / cTAR의 heteroduplex를 수득하는 상보 DNA 서열 (cTAR)와 TAR-RNA 서열의 꼭대기 부에 대응하는 올리고 뉴클레오티드 우리의 경우, 상보적인 핵산을 안정적으로 구조화 사본 간의 어닐링을 중재하도록 NC를 사용 . NC의 존재 TAR / cTAR 어닐링 반응의 분석은 천연 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (PAGE)에 의해 조사 될 수있다.
이 프로토콜은 빠르게 안정 헤어핀 구조에 접어 실내 온도 올리고 뉴클레오티드에서 어닐링에 NAME 분석을 수행하는 방법을 보여줍니다, 어떻게 실험의 반응 가능한 문제 해결의 결과를 분석합니다. 핵산의 방사성 라벨이 요청하고, detecti되지올리고 뉴클레오티드의 밴드에 종래의 염색 방법에 의해 수행 될 수있다. 재조합 전체 길이 단백질 또는 NC의 잘린 합성 버전을 사용 분석은, NC, RNA 및 DNA에 강한 결합과 상관 관계를 나타낸 활성을 억제 스레딩 인터 칼의 식별을 할 수 있습니다. (14)
Protocol
Representative Results
Discussion
NAME 신속 HIV-1, 신규 한 항 HIV 약물 검색 흥미로운 타겟의 뉴 클레오 캡시드 단백질의 샤페론 활성 억제를 평가할 수 분석법이다. NC 빠르고 안정된 폴딩 달리 그주의 소둔이어서 고온에서 열 변성을 필요 실온 핵산에 어닐링. 분석은 어느 전장 NC 또는 절단 (12-55) NC로 수행 될 수있다 : 두 경우 두 핵산 (RNA와 상보적인 DNA 카피)를 급속 어닐링된다. 이 잘린 NC 펩타이드와 문학의 관찰과 일치 : 소둔 TAR 혀끝 루프의 보완 순서로, 약한 NC 바인딩 사이트의 보완 혀끝 루프의 상호 작용에 의해 다음 cTAR의 줄기를 효율적으로 용해에 의해 시작되어, 확장 어닐링 하이브리드 여러 가지 불안정한 중간체를 통해 종료. (21)
NC는 매우 안정적인 제자입니다EIN과 몇 가지 문제가 수행 NAME이 발생할 수있다. 이것이 실현되지 않으면, 겔 정확한 위치 핵산 밴드를 표시하지 않을 것이다 : 그것은 그러나 버퍼 반응을 정지하는 데 사용되는 젤 로딩 갓 만든 SDS를 추가하는 것이 매우 중요하다. 그 올바르게 단백질을 변성 및 핵산과의 긴밀한 복잡한에서 분리 젤 로딩 버퍼에 존재해야 겔 전기 영동 SDS에 의해 TAR / cTAR의 heteroduplex를 시각화 그래서 사실, NC는 핵산 결합 단백질이다. 이것은 또한 겔 동작 동안 시프트 밴드의 형성 즉, 실험의 가능한 문제이다. 이 효과는 전체 길이 NC는도 2에서와 같이 사용될 때, 특히 명백하며, 핵산에 강한 응집 효과를 갖는, 매우 기본적인 N 말단 꼬리의 존재에 연결된다.
단말기 기본 꼬리의 존재는 쇼로, 어닐링 반응을 억제하는 것이 더욱 어렵게 할 수있다N 그림 3 사용하여 화합물 1, 대표 스레딩 인터 칼, TAR와 cTAR의 줄기 루프 구조의 안정화에 특히 효율적인 즉, 인터 칼에. 사실, 핵산과 상호 작용이 타입의 벌지와 루프 염기쌍으로 벌키 치환체 쉽게 관통을 허용 이중 나선의 연속성을 방해 할 때 선호된다. 이러한 핵산 결합제 의해 TAR과 cTAR의 안정화는 이전 두 개의 올리고 뉴클레오티드의 용융 온도 증가의 판정에 의해 분석 하였다. (14) 또한, 용융 온도의 증가는 HIV-1 NC 의해 촉매 어닐링 저해와 상관 관계, heteroduplex를 TAR / cTAR의 감소 형성으로 이어지는 및 스레딩 인터 칼은 TAR 요소로 RNA의 동적 구조에 대한 바인더의 흥미로운 클래스 있음을 나타냅니다. (14)
작용 기전은 이러한 콤포넌트에 대해 호출도 4에 도시 된 바와 같이 unds 추가로, 다른 대안적인 형식 NAME 분석을 수행함으로써 확인 될 수있다 : 인터 칼의 경우 heteroduplex를 어닐링의 억제 향상 약물이 두 절첩 올리고와 함께 배양 될 때. 이러한 NC 단백질의 직접적인 결합제 다른 작용 메커니즘으로 작용하는 화합물은 다른 모드에 의해 예비 배양 덜 영향을받을 것이다. NAME 분석 따라서 NC 억제제의 식별을 위해 화합물의 라이브러리를 스크리닝하는 데 사용될 수있는 두 가지 방법으로 수행하고, NC 대상으로 항 HIV 약물을 검색하는 동안 또한 포지티브 히트 작용 추정 메커니즘을 평가. 분명히 식별 NC 억제제의 작용 메카니즘에 대한 특정 주장 단독 이러한 기술의 사용은 충분하지 않고, 다른 적합한 생화학 적 분석은 작업 가설을 유지하기 위해 필요하다. 14
마지막으로, 그것은 매우 NAME 사용 강조되어야시험 화합물에 의한 NC의 "체외"억제에 대한 귀중한 정보를 제공 재조합 또는 합성 중 정제 효소,. 이것은 "장점과 단점"분석의이다 : NAME 잘 가상 스크리닝을 보완 할 수 및 분자 모델링을 신속하게 구조 활동 관계를 구축하고 분석 할 수 있도록하고 결국 합성과 약물 디자인을 리디렉션, 신약 개발 프로그램의 예비 단계에 접근한다. 다른 생화학 적 분석은 HIV 약물 개발 프로젝트에 사용하지만, 이름은 바이러스에 감염된 세포에서 추정 억제제의 효과에 대한 정보를 제공하지 않습니다.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Ministero degli Affari Esteri (MAE, DRPG, Unità per la cooperazione scientifica e tecnologica, Grant: PGR Italy-USA) and by MIUR, Progetti di Ricerca di Interesse Nazionale (Grant: 2010W2KM5L_006).
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| cTAR, 29-mer DNA oligo. Desalted. HPLC purified. | Metabion International AG | Store the stock solution at -20 °C | |
| TAR, 29-mer RNA oligo. Desalted. HPLC purified. | Metabion International AG | Store the stock aliquot at -80 °C | |
| (12-55)NC peptide | EspiKem srl | Store the stock solution at -20 °C | |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030 120 086 | Autoclave before use |
| 0.5 mL tubes | Eppendorf | 0030 121 023 | Autoclave before use |
| Biosphere Filter Tips 0.1-10 µL | Sarstedt | 701,130,210 | |
| Biosphere Filter Tips 2-20 µL | Sarstedt | 70,760,213 | |
| Biosphere Filter Tips 200 µL | Sarstedt | 70,760,213 | |
| Syringe Filter 0,22 µm | Biosigma srl | 51,798 | |
| Ethanol | Carlo Erba | 414631 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | 71725-50G | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418-1L | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 71376-1KG | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B0252-2.5KG | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid | Sigma-Aldrich | E5134-500G | |
| Magnesium Perchlorate | Sigma-Aldrich | 222283-100G | Store the 1M solution at -20°C |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 49770-1L | |
| Bromophenol Blue | GE Healthcare Life Sciences | 17-1329-01 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281-100ML | |
| Ammonium Persulfate | Sigma-Aldrich | A7460-500G | Prepare the 10% solution freshly before use |
| Acrylamide-bis ready-to-use solution 40% (19:1) | Merck Millipore | 1006401000 | Polyacrylamide is highly neurotoxic: wear gloves during the gel casting |
| Tris ultrapure | Applichem | A1086,1000 | |
| DEPC-treated water | Ambion | AM9922 | |
| Centrifuge 5415R | Eppendorf | 22,621,408 | |
| NanoDrop 1000 spectrometer | Thermo Scientific | ||
| UV-VIS spectrometer Lambda 20 | Perkin Elmer | ||
| Protean II xi Cell | Bio-Rad | 165-1803 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 164-5050 | |
| SybrGreen II RNA Gel Staining | Lonza | 50523 | Make the 1/10000 dilution in TBE 1X. Store it in the dark at 4°C for two weeks |
| Geliance 600 Imaging System | Perkin Elmer |
Riferimenti
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