Cultura e co-coltura di mouse ovaie e follicoli ovarici

Tutto il lavoro degli animali è stato effettuato in conformità con le linee guida istituzionali su licenza dalla UK Home Office (numero di licenza del progetto PPL 60/1726 e 60/4026). Nota: animali Casa in conformità con i requisiti legali del Regno Unito in una luce 14 ore e 10 ore fotoperiodo scuro. Condurre esperimenti su animali con topi C57Bl6J wild type, topi Tau-GFP che hanno espressione ubiquitaria di proteina verde fluorescente (GFP) 8, e Thy1-YFP topi con espressione occasionale di proteina fluorescente gialla (YFP) in un sottogruppo di cellule neuronali 9: sia linee transgeniche sono stati allevati su uno sfondo C57Bl6J. 1. Condizioni di lavoro e di preparazione degli strumenti Eseguire tutta la preparazione media, dissezioni tessuto, e il lavoro cultura in una cappa a flusso laminare per garantire la sterilità: questo evita il requisito dell'aggiunta di antibiotici ai media. Consenti sempre media / piastre di coltura / stoviglie embrione equilibrareper almeno 1 ora, in un forno a 37 ° C (medio dissezione / piatti embrione) o 37 ° C, 5% CO 2 incubatore (terreno di coltura e piastre), prima dell'uso. Immergere pipette di vetro in soluzione allo 0,1% di albumina di siero bovino (BSA) per circa un'ora, e poi lasciare asciugare. Tirate pipette nella fiamma di un becco Bunsen, piegando il vetro mentre lo fate, per la produzione di pipette di vetro curvato finemente disegnate. Dopo la pipetta è tirato, effettuare un taglio netto con un cutter vetro. Forno sterilizzazione a 160 ° C per circa 45 min. NOTA: Un negozio di queste pipette di vetro sarà necessario trasferire ovaie e follicoli. 2. Preparazione di dissezione e di cultura media Preparare Dissection media. Sciogliere 3 mg / ml BSA in Leibowitz L15 medio e filtro sterilizzare attraverso un 0,2 micron pori 25 mm Filtro diametro. Neonatale Ovaio Cultura. Per preparare mezzo per la cultura ovaio neonatale, fare 1 ml di terreno per each dell'ovaio che saranno coltivate. Sciogliere 3 mg / ml BSA in α-Minimal Essential supporti (αMEM) e filtro sterilizzare attraverso un 0,2 micron pori da 13 mm filtro di diametro in una provetta sterile. Per preparare piatti per la cultura ovaio neonatale, aggiungere 1 ml di terreno di coltura neonatale ovaio in ogni pozzetto (un ovaio per pozzetto) di un 24-pozzetti. Utilizzando pinze sterili orologeria, posizionare una membrana di policarbonato sulla parte superiore del mezzo in ciascuna superficie ben, lucido. UV sterilizzare le membrane prima dell'uso. Cultura follicolo. Per preparare mezzo per la cultura follicolo, supplemento α-Minimal media Essential con 1 UI / ml ricombinante follicolo ormone stimolante, 5 mg / ml di acido ascorbico e il 5% v / v di siero ottenuti da topi femmina adulti. Filtro sterilizzare attraverso un 0,2 micron pori da 13 mm filtro di diametro in una provetta sterile. Filtro sterilizzare olio siliconico attraverso un filtro di diametro 0,45 micron pori, 25 mm, in una provetta sterile. Per preparare plaTES, mettere 30 gocce microlitri di follicolo terreno di coltura in ciascun pozzetto di una cultura non-tessuto trattato 96 pozzetti Micropiastra tutto bene, utilizzando solo la prima riga di ogni disco (per permettere follicoli di essere spostati in nuovi file ogni giorno oltre il periodo di coltura). Sovrapporre accuratamente media con 70 ml di olio di silicone sterilizzato, per prevenire evaporazione media. Follicolo-ovaio Co-cultura. Preparare mezzo per follicolo-ovaio co-cultura per la cultura follicolo al precedente punto 2.3.1, che costituiscono 1 ml di media per ogni co-coltura follicolo-ovaio in fase di realizzazione. Per preparare piastre, aggiungere 1 ml di terreno in ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti. Utilizzando pinze sterili orologeria, posizionare una membrana Nucleopore sulla parte superiore del mezzo in ciascuna superficie ben, lucido. UV sterilizzare le membrane prima dell'uso. 3. neonatale Ovaia Dissection e Cultura Mettere 1 ml di terreno dissezione in ogni piatto embrione di vetro sterile. <li> Cull cuccioli neonati topo di età compresa tra 0 e postnatale giorno 5, abbattimento per decapitazione in base alle normative IT Home Office. Afferrare la pelle che ricopre la parete addominale con un paio di belle pinze dissezione e fare una grande incisione nella parete pelle e del corpo. Aprire il dell'incisione così l'intero addome è esposto. La vescica è solitamente gonfio in questa fase e può essere forato per rendere più facile la dissezione. Spostare le budella fuori del modo con pinze orologiai. Seguire le corna uterine dalla vescica fino al rene su ogni lato. L'ovario si trova appena al di sotto del rene nella parte superiore dell'utero e apparirà come una struttura cloud come sotto un microscopio da dissezione. Afferrare l'ovario delicatamente con una pinza orologiaio, e usare le forbici per recidere il suo attaccamento verso l'utero. Trasferire la coppia di ovaie in piatti di embrioni contenenti medio dissezione pre-riscaldato. Effettuare dissezione multa di ovaie al microscopio dissezione su una sta riscaldatage (37 ° C). Utilizzare aghi da insulina per tagliare via il sacco della borsa e il materiale in eccesso compreso le tube di Falloppio, fino a che solo l'ovaio rimane. Trasferire ciascun ovaio nel pozzetto di una piastra di coltura preparato al passo 2.2.2, usando una pipetta di vetro curvo finemente disegnato, un ovaio sopra l'membrana (Figura 1A). Cultura a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. Cambiare la media ogni due giorni. Utilizzare una pipetta di scambiare 50% del mezzo in ogni pozzetto per pre-gasati fresco medio: luogo la punta della pipetta sul bordo del pozzo di mezzo per non disturbare la membrana. Mantenere le culture fino a 6 giorni. Al termine della coltura, congelamento medie e fissare o congelare ovaie dopo un breve lavaggio in PBS, come richiesto. Fissare ovaie nelle fissante di Bouin per 90 minuti per l'analisi istologica, o in 10% formalina tamponata neutra per 90 minuti per l'analisi immunoistochimica. Snap congelare ovaie mettendo in tessutoun tubo di polipropilene, ponendo la provetta in ghiaccio secco per 5-10 minuti prima del congelamento a -70 ° C per la successiva estrazione di proteine ​​o di mRNA. 4. follicolo Dissection e Cultura Cull 19-23 giorni vecchi topi di sesso femminile e isolare le ovaie. Bagnare il pelo con il 70% di etanolo prima di effettuare qualsiasi incisioni. Pizzica la pelle con pinze ad attacco smussato e fare una grande incisione nell'addome con le forbici dissezione, penetrando attraverso sia la pelle e la parete del corpo. Spostare l'intestino fuori strada utilizzando una serie di strumenti di dissezione più fine e individuare l'utero. Seguire l'utero fino alla ovaio che si trova sotto il rene su ogni lato. Afferrare delicatamente il ovaio utilizzando un paio di pinze orologiaio, recidere l'attaccamento ovaie all'utero con belle forbici dissezione. Evitare di raccogliere troppo del cuscinetto adiposo ovarico. Raccogliere le ovaie e trasferire in un embrione piatti contenenti medio dissezione pre-riscaldato. Respostare la borsa ovarica con aghi di insulina per tagliare via il sacco della borsa e il materiale in eccesso compreso le tube di Falloppio, fino a che solo l'ovaio rimane. Circa dimezzare ogni ovaio utilizzando aghi da insulina. Trasferire accuratamente ciascun ovaio mezzo in un vetrino di orologio individuale contenente 1 ml di mezzo dissezione. Coprire ogni vetro d'orologio con un vetrino per evitare l'evaporazione del mezzo e per garantire la sterilità. Vetri da orologio Conservare contenenti metà ovariche in un forno a 37 ° C fino al momento dell'uso, ma eseguire la dissezione successivo passo appena possibile. Gettare il tessuto conservato in questo modo per più di un'ora. Vetro d'orologio Transfer contenente un mezzo ovaio a una fase microscopio riscaldata 37 ° C in una cappa a flusso laminare. Circa sezionare ovaio in grossi pezzi con due aghi di insulina, al fine di individuare follicoli pre-antrali fine come segue: esse conterranno 2-3 strati di cellule della granulosa e hanno un diametro di circa 180-200 micron. Sezionare manualmente qualsiasi ifollicoli dentified utilizzando un ago da insulina e un 30 x 0,25 millimetri ago di agopuntura che è stato fissato in un supporto dell'ago. Fare attenzione a rimuovere la maggior parte dello stroma circostante, ma non danneggiare la lamina basale di follicoli (vedere Figura 1B). Utilizzare una pipetta di vetro curvo finemente disegnati per trasferire accuratamente follicoli sezionati in un vetro da orologio raccolta contenente medio dissezione pre-riscaldato. Fare attenzione a tenere i follicoli all'interno della sezione di calibro sottile di pipetta per evitare di perdere i follicoli. Follicoli misurare con precisione utilizzando un reticolo oculare calibrato inserito in un microscopio da dissezione. Selezionare follicoli per la cultura solo se misurano 190 ± 10 micron di diametro. Ulteriori selezionare solo, follicoli sferici sani per la cultura; questi saranno trasparente, senza zone atresici scure, e hanno una lamina basale intatta, insieme ad alcuni tessuti durale allegato: scartare le follicoli che non si adattano a questa descrizione. Un rendimento compreso tra 10-15 follicoli per dell'ovaio è buono. Utilizzare una pipetta di vetro curvo finemente disegnato per trasferire un singolo follicolo nel pozzo di una piastra come al precedente punto 2.3.3. Posizionare accuratamente il follicolo nel fondo del pozzo (e non nello strato superiore dell'olio). Cultura a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. Follicoli cultura per 6 giorni spostano follicoli in un mezzo fresco e contenente tutti i giorni. Preparare la riga successiva nella piastra a 96 così come in piastra preparazione al passo 2.3.3. Piastra di ritorno per l'incubatore per almeno un'ora, per raggiungere l'equilibrio. Trasferire follicoli nei pozzetti freschi di media, utilizzando una pipetta di vetro finemente disegnato. Se in qualsiasi punto della coltura follicoli devono essere lasciati per due giorni prima di passare in mezzo fresco, posizionare ogni follicolo in un minimo di 60 microlitri (anziché 30 ml) di mezzo di coltura goccioline follicolo. Per raccogliere i dati sulla crescita del follicolo, misurare i follicoli quotidiano, utilizzando un eyepiece reticolo montato in un microscopio da dissezione. Lo strato olio alterare le misurazioni del diametro del follicolo, quindi calcolare il coefficiente di calibrazione per il set-up. Al termine della coltura, congelamento medie e fissare o congelare tessuto per successive analisi, come nel precedente punto 3.10. Follicolo-follicolo Co-cultura. Cultura due follicoli insieme, per indagare le interazioni tra i follicoli. La cultura come sopra, ma posizionare due follicoli side-by-side, in contatto, in un pozzo. Mettere 100 gocce microlitri di follicolo terreno di coltura in ciascun pozzetto di una cultura non-tessuto trattato 96 pozzetti Micropiastra piatto ben, sovrapponendo media con 100 ml di olio di silicone sterilizzato. Non trasferire follicoli in pozzi freschi come al punto 4.13, ma invece di utilizzare una punta di gel bene a cambiare il 50% del terreno di ogni altro giorno. Per identificare origini tessuto all'interno della co-coltura, co-coltura follicoli ciascuna da una fonte genetico diverso, ad esempio one dall'ovaio di un tipo di mouse selvaggio, e l'altro dalle ovaie di un mouse con espressione ubiquitaria di GFP. Se si utilizza GFP o YFP tessuto, minimizzare l'esposizione del tessuto alla luce il più possibile, durante la coltura, e attraverso i passi fissaggio / elaborazione successivi. NOTA: E 'normale per i due follicoli di crescere insieme in un unico, unità' a due follicolo '(vedi Figura 1C). 5. follicolo-ovaio co-culture Sezionare ovaie e follicoli fuori come nelle sezioni 3 e 4 di cui sopra. Inserire un ovaio neonatale in cima ad una membrana, in una piastra preparata come al precedente punto 2.4.2. Posizionare accuratamente un singolo follicolo in contatto con un polo dell'ovaio neonatale, utilizzando una pipetta di vetro curvo finemente disegnato. Cultura a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore per 5 giorni. Per distinguere tra l'origine tessuto all'interno della co-coltura, utilizzare ovaie e follicoli di due diversi cosìurces, ad esempio uno da un tipo di topo selvatico, e uno da un mouse con espressione ubiquitaria di GFP. Sostituire 500 ml di media al giorno, come al precedente punto 3.8, ma con terreno di coltura follicolo. Durante co-coltura, il follicolo spesso viene incapsulato dall'ovaio (Figura 1D). Al termine della coltura, congelamento medie e fissare o congelare tessuto per successive analisi, come nel precedente punto 3.10. 6. Fissazione, Immunocytochemistry e Imaging di Tissue Colta Alla fine della coltura, lavare tessuti in PBS e trasferimento 100 microlitri (follicolo) o 1 ml (ovaio) e 10% formalina tamponata neutra, e fissare per 1 ora su ghiaccio. Spostarsi attraverso 3 lavaggi di 1x PBS a 4 ° C. Per immunocitochimica su follicoli, trasferimento tra pozzetti di una 96 pozzetti Micropiastra andata bene con una pipetta di vetro curvo finemente disegnati, con ogni ben contenenti lavaggi o trattamenti diversi. Per immunocitochimica su Ovaries (o dell'ovaio follicolo-co-culture), incorporare nel 4% agarosio gel e la sezione a 50 micron con un vibrotome. Sezioni Float nei pozzetti di una piastra da 24 pozzetti di applicare lavaggi o trattamenti, rimuovendo con una pipetta. Per l'imaging: trasferire le sezioni agarosio alle diapositive di vetro piano e montare con mezzo di montaggio; o follicoli di trasferimento (o complessi follicolo-follicolo) a vetrini cavità e montare con non indurente mezzo di montaggio. Esemplari immagine utilizzando un microscopio confocale.