الثقافة والمشارك ثقافة ماوس المبايض وحويصلات المبيض
Summary
يصف هذا البروتوكول الثقافة الابتدائية / ثقافة مشتركة من الماوس أنسجة المبيض، وذلك باستخدام المبايض من الفئران حديثي الولادة وحويصلات المبيض الفردية من الفئران سابق للبلوغ. تقنيات ثقافة تدعم التنمية بطريقة الفسيولوجية للغاية، مما يسمح للتحقيق في تأثير العوامل الخارجية على المبيض، والتفاعلات بين الحويصلات المبيضية.
Abstract
ويتكون المبيض الثدييات من الحويصلات المبيضية، كل المسام التي تتكون من بويضة واحدة تحيط بها الخلايا المحببة الجسدية، والمغلقة معا داخل الغشاء القاعدي. وضعت بركة محدود من بصيلات أسفل أثناء التطور الجنيني، عندما البويضات في اعتقال الانتصافي تشكل ارتباط وثيق مع الخلايا المحببة بالارض، وتشكيل بصيلات البدائية. قبل أو بعد الولادة مباشرة، المبايض الثدييات تحتوي على إمدادات حياتهم من بصيلات البدائية، من هذه النقطة فصاعدا هناك إصدار ثابت من بصيلات في بركة الجريبي المتنامية.
المبيض هو الانقياد وخاصة في التنمية في المختبر، مع بصيلات تنمو بطريقة الفسيولوجية للغاية في الثقافة. يصف هذا العمل ثقافة المبايض حديثي الولادة كلها تحتوي على بصيلات البدائية، وثقافة حويصلات المبيض الفردية، والطريقة التي يمكن أن تدعم تطوير المسام من غير ناضجة من خلال لpreovuمرحلة latory، وبعد ذلك البويضات التي هي قادرة على الخضوع الإخصاب في المختبر. العمل المذكورة هنا يستخدم نظم الاستزراع لتحديد كيفية تأثر المبيض عن التعرض لمركبات الخارجية. أيضا نحن تصف نظام المشاركة في الثقافة، والذي يسمح التحقيق في التفاعلات التي تحدث بين تزايد بصيلات والتجمع غير نموا من بصيلات البدائية.
Introduction
ويتكون المبيض الثدييات العرض العمر الأنثى من البويضات، كل الواردة ضمن جراب المبيض. يتم تشكيل بصيلات قبل الولادة في يستريح، مرحلة البدائية: بعد أن يتم تأسيس تجمع المسام، هناك حركة مستمرة وتدريجية من بصيلات من بدائية في بركة جريب المتنامية. كما بصيلات تبدأ في النمو، ويطورون من خلال المراحل الابتدائية والثانوية، preantral ثم الغارية، حتى يصلوا إلى سابق للإباضة، أو غراف، المرحلة. فقط البويضات من الحويصلات سابق للإباضة لهم الولاية التنموي الكامل، وقادرة على دعم التطور الجنيني إلى المدى، إذا المخصبة.
المعروف منذ وقت طويل المبيض لتطوير بطريقة الفسيولوجية للغاية في المختبر. هذا ومن المرجح أن يكون راجعا إلى كل جريب المبيض تحتوي في داخلها الخلايا اللازمة لدعم بويضة من مرحلة غير ناضجة (وعند هذه النقطة يصبح غير قادر على إكمال الميتوزي به) من خلال لرانه مرحلة المختصة تنمويا (وعند هذه النقطة يمكن أن تدعم بشكل كامل الانتهاء من الانقسام المنصف والتسميد وتطور الجنين مما يؤدي إلى المدى).
وقد أدى الطبيعة الفسيولوجية للتنمية المبيض في المختبر إلى الاستخدام الواسع للتقنيات زراعة المبيض. ونتيجة لذلك، وقد استخدمت في المختبر وسائل للتحقيق في التنظيم للتنمية المبيض، أمراض المبيض (على سبيل المثال أن من متلازمة تكيس المبيض، متلازمة تكيس المبايض)، والفحص عن كيفية المبايض / البويضات تتأثر التعرض للمواد الكيميائية، وأيضا بهدف العملي ل الحصول على البويضات fertilizable من الحويصلات المبيضية البدائية. حتى الآن، وقد تحقق هذا الأخير فقط باستخدام الماوس المبيض الأنسجة 1، على الرغم من أن تقنيات زراعة باستخدام بصيلات من الثدييات الكبيرة، بما في ذلك البشر، قد تحسنت بشكل كبير في السنوات الأخيرة 2،3.
وصفنا هنا عدة طرق الثقافة باستخدام الماوس أنسجة المبيض. وmetho الأوليستخدم د كلها المبايض الماوس حديثي الولادة، ويدعم تشكيل والتنمية في وقت مبكر من بصيلات البدائية 4. يدعم النظام الثاني نمو الفردية، جراب المبيض سليمة من preantral في وقت متأخر إلى مرحلة سابق للإباضة. باستخدام هذه التقنية، المسام يمكن تربيتها بشكل فردي، أو في أزواج 5،6. وأخيرا، نحن تصف نظام المشاركة في الثقافة، والجمع بين تقنيات الأولين في طريقة تسمح التحقيق في التفاعلات بين النمو والحويصلات المبيضية البدائية 7.
ثقافة الفردية حويصلات المبيض سليمة تتيح نمو بصيلات يتم تحديدها من القياسات بصيلات اليومية خلال الفترة الثقافة، في حين أن التحليل المتوسط يسمح التحقيق في بصيلات / إنتاج هرمون المبيض. ويمكن تحقيق المزيد من التحليلات الأنسجة من قبل مجموعة من بصيلات أو أنسجة المبيض في نهاية الثقافة، لتحليل النسيجي / immunohistological أو للتجهيز لاحق على سبيل المثال للحصول علىمرنا أو البروتينات.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن هنا وصف نظم الاستزراع المختلفة التي يمكن استخدامها لدعم تطوير الماوس حويصلات المبيض في المختبر، وذلك باستخدام المبايض حديثي الولادة كلها تحتوي فقط على المراحل الأولى المسام، الفردية حويصلات المبيض preantral وأيضا الثقافات مشاركين للأنسجة اثنين.
ثقافة الأطفال حديثي الولادة المبايض الماوس تدعم تطوير المبيض في وقت مبكر، بدء نمو بصيلات ولا سيما ما يصل إلى المرحلة الثانوية جراب. وهناك مجموعة من أعمار الفئران حديثي الولادة يمكن استخدامها لهذه الثقافات، وهذا يتوقف على مراحل تطور المصالح. إذا ويتم الحصول على المبايض من الفئران حديثي الولادة، سيكون تشكيل بصيلات جارية ولكن لم يكتمل بعد: سوف ثقافة تدعم جزئيا على الأقل تشكيل بصيلات استمرار يليه نمو بصيلات. بدلا من ذلك، استخدام المبايض من الفئران حوالي أربعة إلى خمسة أيام من العمر (التي تشكل المسام هو الوقت كاملة بالفعل) النتائج في ثقافة عدد أكبر من FOLLI البدائية ومتناميةجسيمات 12. وتشمل الجوانب المفيدة للتقنية محددة الموصوفة هنا استخدام العائمة الأغشية البولي، والتي تسمح بمزيد من الأوكسجين في الأنسجة، والثقافة في وسيلة أساسية جدا تتألف فقط αMEM وBSA، وتجنب استخدام المواد المضافة غير محددة مثل المصل. لا يبدو ثقافة المبايض كله لدعم التنمية ما بعد مرحلة جريب الثانوية، مع تطور لاحق تتطلب تغييرا في الأسلوب، مثل تشريح المجمعات خلية جريب-المحببة من المبيض حديثي الولادة مثقف 1.
ويمكن تطوير مراحل لاحقة من تطوير المسام في المختبر عن طريق تشريح خارج الفرد، سليمة بصيلات قبل الغارية في وقت متأخر، والتي يمكن زراعتها إلى مرحلة سابق للإباضة في الثقافة مع الحفاظ على هيكلها ثلاثي الأبعاد. استخدام بصيلات سليمة لهذه التقنية الثقافة يحافظ على العلاقة بين مكونات مسامي مختلفة كما يحدث في الجسم الحي. ثيالصورة نظام الثقافة يمكن استخدامها للحصول على البويضات التي يمكن أن تدعم الإخصاب وتطور الجنين اللاحقة.
كما يمكن الحصول على البويضات Fertilizable من الماوس المبايض حديثي الولادة باستخدام بروتوكول ثقافة الأولي الكثير كما هو موضح هنا، تليها مرحلة ثانية يتم خلالها نمت المجمعات خلية بويضة-المحببة في المختبر 1. وتشمل الأنظمة الأخرى المستخدمة في كثير من الأحيان إلى حد ما اليوم ثقافة بصيلات أو أنسجة المبيض الذي تم مغلفة في مواد مثل هيدروجيل الجينات، لتقديم الدعم (انظر، على سبيل المثال، Tagler وآخرون 13). الكثير من التركيز على التنمية الطريقة الآن هو تحسين تقنيات الثقافة لالمبيض وبصيلات من الثدييات الكبيرة، مع الهدف الطويل الأجل للحصول على البويضات fertilisable من بصيلات البدائية من مجموعة من الأنواع، بما في ذلك البشر.
في وقت واحد، المبايض الثدييات تحتوي على بصيلات في مجموعة من المراحل التنموية، مع interactioنانوثانية بين بصيلات تؤثر على تنظيمها. ويفهم من هذا الجانب وظيفة المبيض سيئة وصعبة لفحص في الجسم الحي. طريقة النهائي الموصوفة هنا يستخدم أنظمة الثقافة تشارك في دعم تطوير مراحل مختلفة من بصيلات في المختبر. إذا لزم الأمر، واحد أو كلا الأنسجة يمكن قبل المعاملة في الجسم الحي أو في المختبر للمشاركة في الثقافة السابقة. أنظمة شارك في ثقافة مثل هذه توفر وسيلة مثالية التي لدراسة التفاعلات جريب-المسام، على سبيل المثال كيف المتنامية، الجريبات الغارية تؤثر على بركة بصيلات البدائية، والجوانب البيولوجيا المبيض التي أثبتت صعوبة في دراسة حتى الآن.
تقنيات زراعة المبيض كلها هي واضحة إلى حد ما، على الرغم من تشريح دقيق هو مطلوب لتجنب تلف الأنسجة عرضيا. تشريح من بصيلات الفردية هي تقنية متخصصة، والتي تتطلب الممارسة المتكررة قبل أن يتم تشريح بصيلات في المرحلة المناسبة للخروج من المبيض سليمة ودون ضرر. ومن الأهمية بمكانلتشريح من بصيلات الفردية بعناية، أو أضرار لحقت به خلال بروتوكول تشريح يمكن أن يسفر عن وفاة بصيلات خلال الفترة الثقافة اللاحقة. حيث يتم وضع بصيلات مباشرة في البئر لوحات عيار مكروي، فمن المهم استخدام البلاستيك ثقافة غير الأنسجة المعالجة الوحيدة، للحد من الطلاء أسفل الخلايا قرابي على البلاستيك: إذا تم استخدام زراعة الأنسجة بلستيكور المعالجة، سوف بصيلات نعلق على قاعدة من البئر وتمزق عندما يكبرون. للجميع العمل المشترك والثقافة، ويجب أن توضع الأنسجة مباشرة على اتصال مع بعضها البعض.
المتوسط المفصلة أعلاه لاستخدامها في تقنية زراعة بصيلات يتضمن إضافة مصل الفأر. فمن الممكن أن تحل محل مصل الفأر مع المصل البقري الجنين، ولكن فقط دفعات من حين لآخر من هذا القبيل الأمصال الدعم الكامل تطوير المسام إلى مرحلة سابق للإباضة، مع دفعة الاختبار المطلوب لتحديد المصادر المناسبة. دفعة اختبار FSH هو المستحسن أيضا، حيث أن يوني الدوليةTS التي يتم من خلالها تقييم FSH القرين بصورة فجة فقط لنمو بصيلات في المختبر. إذا جراب تمزق يحدث بشكل روتيني خلال الفترة الثقافة، والتفكير في استبدال حمض الاسكوربيك الأسهم مع دفعة جديدة.
تقنيات لا تتطلب معدات متخصصة لا سيما أخرى من تشريح المجاهر وحاضنات زراعة الأنسجة، على الرغم من استخدام غطاء تدفق الصفحي وتقنية معقمة جيدة تسمح للحويصلات المبيض إلى أن تربيتها في غياب المضادات الحيوية، كما هو الحال في الطرق الموضحة هنا. هذا يمكن أن يكون مفيدا، لتجنب أي تأثير ضار محتمل من المضادات الحيوية على البويضات، لا سيما إذا أريد لها أن تكون المخصبة التالية الثقافة. حيث أنه من غير الممكن للعمل في بيئة معقمة، فإنه من المستحسن أن إضافة المضادات الحيوية لتشريح والثقافة وسائل الإعلام.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Work was funded by MRC grant G1002118.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Leibowitz L15 | Invitrogen | 11415049 | |
| αMEM | Invitrogen | 22571020 | Supplied as sodium bicarbonate buffered (2200 mg/L) |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A9418 | For dissection medium |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3311 | For culture medium |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | For coating glass pipettes |
| Mouse serum | – | – | Collected from cardiac puncture |
| FSH | Merck Serono | Gonal F | Batch testing is often necessary. Make up stock solution of 1IU/10µl in αMEM and store at -20°C. |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4034 | Make up stock of 5mg/ml in αMEM and store at -20°C. |
| Silicon oil | VWR | 630064V | Dow Corning Silicone Fluid 200/50cS |
| Syringe filters (25mm, 0.2µm) | Greiner | 16532K | Cellulose acetate filter: for filtering larger (> 5mls) volumes of medium. |
| Syringe filters (13mm, 0.2µm) | Iwaki | 3032-013 | Cellulose acetate filter: for filtering smaller (< 5mls) volumes of medium |
| Syringe filters (25mm, 0.45µm) | Iwaki | 2053-025 | Cellulose acetate filter: for filtering oil. |
| Sterile tubes | Greiner | 187261 | |
| 24 well plate | Greiner | 662160 | |
| 96 well round bottom plate | Iwaki | 3875-096 | Use only non-tissue culture treated plates |
| 96 well flat bottomed well | Iwaki | 3860-096 | Use only non-tissue culture treated plates |
| Whatman nucleopore membranes | Camlab | WN/110414 | Use shiny surface up, polycarbonate, 13mm diameter, 8.0µm pore size |
| Insulin needles | BD medical supplies | 037-7606 | 0.33mm (29G) +1ml |
| Glass embryo dishes | VWR | 720-0579 | Sterilise then warm before use |
| Glass pipettes | Fisher Scientific | 10209381 | BSA coated before use |
| Gel tips | AlphaLabs | LW1103 | |
| Acupuncture needles | Acumedic LTD | 30mmx0.25 Type C | |
| Bouin’s fixative | Sigma Aldrich | HT10132-1L | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT5014-120ml | |
| 1.5 ml polypropylene tubes | Greiner BioOne | 616201 |
Riferimenti
- Brien, M. J., Pendola, F. L., Eppig, J. J. A revised protocol for in vitro development of mouse oocytes from primordial follicles dramatically improves their developmental competence. Biol. Reprod. 68 (5), 1682-1686 (2003).
- Fortune, J. E., Yang, M. Y., Muruvi, W. The earliest stages of follicle development: follicle formation and activation. Soc. Reprod. Fertil. Suppl. 67, 203-216 (2010).
- McLaughlin, M., Kinnell, H. L., Anderson, R. A., Telfer, E. E. Inhibition of phosphatase and tensin homologue (PTEN) in human ovary in vitro results in increased activation of primordial follicles but compromises development of growing follicles. Mol. Hum. Reprod. 20 (8), 736-744 (2014).
- Morgan, S., Lopes, F., Gourley, C., Anderson, R. A., Spears, N. Cisplatin and doxorubicin induce distinct mechanisms of ovarian follicle loss; imatinib provides selective protection only against cisplatin. PLoS One. 8 (7), e70117 (2013).
- Murray, A. A., et al. Follicular growth and oocyte competence in the in vitro cultured mouse follicle: effects of gonadotrophins and steroids. Mol Hum Reprod. 14 (2), 75-83 (2008).
- Baker, S. J., Srsen, V., Lapping, R., Spears, N. Combined effect of follicle-follicle interactions and declining follicle-stimulating hormone on murine follicle health in vitro. Biol. Reprod. 65 (4), 1304-1310 (2001).
- Campbell, L., Trendell, J., Spears, N. Identification of cells migrating from the thecal layer of ovarian follicles. Cell Tissue Res. 353 (1), 189-194 (2013).
- Pratt, T., Sharp, L., Nichols, J., Price, D. J., Mason, J. O. Embryonic stem cells and transgenic mice ubiquitously expressing a tau-tagged green fluorescent protein. Dev. Biol. 228 (1), 19-28 (2000).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Maiani, E., et al. Reply to: cisplatin-induced primordial follicle oocyte killing and loss of fertility are not prevented by imatinib. Nat. Med. 18 (8), 1172-1174 (2012).
- Spears, N., Bruin, d. r., Gosden, J. P., G, R. The establishment of follicular dominance in co-cultured mouse ovarian follicles. J. Reprod. Fertil. 106 (1), 1-6 (1996).
- Desmeules, P., Devine, P. J. Characterizing the ovotoxicity of cyclophosphamide metabolites on cultured mouse ovaries. Toxicol. Sc. 90 (2), 500-509 (2006).
- Tagler, D., et al. Promoting extracellular matrix remodelling via ascorbic acid enhances the survival of primary ovarian follicles encapsulated in alginate hydrogels. Biotechnol. Bioeng. 111 (7), 1417-1429 (2014).
