Enquête molécule unique adhérence par force atomique Spectroscopie
Summary
A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.
Abstract
La spectroscopie de force atomique est un outil idéal pour étudier des molécules sur des surfaces et des interfaces. Un protocole expérimental pour coupler une grande variété de molécules simples de manière covalente sur une pointe d'AFM est présenté. Dans le même temps la pointe AFM est passive pour prévenir les interactions non spécifiques entre la pointe et le substrat, qui est une condition préalable pour étudier molécules simples attachés à la pointe de l'AFM. Analyses pour déterminer la force d'adhérence, la longueur d'adhérence, et l'énergie libre de ces molécules sur des surfaces solides et bio-interfaces sont peu présentés et références externes pour davantage de lecture sont fournis. molécules d'exemple sont les polytyrosine poly (acides aminés), le polymère greffé PI g -PS et la POPE phospholipide (1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine). Ces molécules sont désorbés de surfaces différentes, comme CH 3 -SAMs, l'hydrogène fin diamant et soutenus bicouches lipidiques dans diverses conditions de solvant. Enfin, laavantages de la force spectroscopiques expériences de molécules simples sont discutés comprenant des moyens pour décider si vraiment une seule molécule a été étudié dans l'expérience.
Introduction
Au cours des 30 dernières années, la microscopie à force atomique (AFM) se est avérée être une technique d'imagerie précieux pour étudier biologiques 1,2 synthétiques et des matériaux et des surfaces 3, car il fournit une résolution spatiale moléculaire dans les trois dimensions et peut être utilisé dans divers solvant environnements. En outre, la force de molécule spectroscopie AFM-unique (SMFS) permet de mesurer des forces allant de la PN μN régime et a donné un aperçu sans précédent par exemple dans le repliement des protéines 4,5, la physique des polymères 6-8, et seule interaction molécule-surface 9 – 12 .La raison d'étudier des molécules simples plutôt que d'un ensemble de molécules est d'éviter les effets qui masquent souvent des événements rares ou états moléculaires cachés moyenne. En outre, une multitude de paramètres moléculaires telles que la longueur du contour, la longueur Kuhn, l'énergie libre d'adhérence, etc., peuvent êtreobtenu. Ceci est détaillé dans les exemples ci-dessous. Dans une expérience typique AFM-SMFS, la molécule sonde est couplé à une pointe très fine par une molécule de liaison. L'embout lui-même est situé à l'extrémité d'un cantilever flexible. Si l'embout est mis en contact avec la surface de la molécule sonde va interagir avec cette surface. En observant la déviation du levier lors de la rétraction de la pointe, la force, et donc l'énergie libre, à détacher de la molécule de la surface peut être déterminé. Pour obtenir des statistiques significatives, un grand nombre de soi-disant courbes force-distance doivent être acquises. En outre, d'avoir de véritables expériences seule molécule (ce est à dire, en utilisant une seule et même molécule sonde sur la durée de l'ensemble de l'expérience) la molécule de la sonde doit être couplé de manière covalente à la pointe de l'AFM. Ici, un protocole expérimental pour la fonctionnalisation cantilever avec une seule molécule par l'intermédiaire d'une liaison covalente est présentée. La seule molécule peut être soit couplé par un amino ou un thiol Groupe à la pointe de l'AFM. Le procédé de conjugaison peut être effectuée dans une large variété de solvants organiques et aqueux () pour tenir compte des propriétés de solvatation des polymères utilisés.
Dans la première partie, un protocole général pour fixer de manière covalente une molécule unique ("molécule de sonde») via une molécule de liaison à une pointe d'AFM est décrit. À cette fin, NHS- organique ou maléimide-chimie est utilisé 13. Avec le protocole de trois molécules d'exemple, le processus d'acquisition de données et d'analyse de données sont décrites et les références de lectures complémentaires sont fournis. Les exemples de molécules sont: le (linéaire) de la tyrosine de polymère, le polymère greffé PI g -PS et la POPE lipidique. Cela inclut de légères variations du protocole, par exemple pour fixer de manière covalente cystéines. En outre, une partie est consacrée à la préparation des surfaces différentes, comme une surface de diamant, un groupe CH 3 -self-assemblé monocouche et les bicouches lipidiques. Ces interfaces ont proven être de bonnes références et des exemples.
Protocol
Representative Results
Discussion
Durant les dernières décennies, des expériences de molécules simples ont donné un aperçu sans précédent sur les mécanismes moléculaires et se est avéré être une approche précieuse en sciences de la vie et au-delà. Pour obtenir de bons et significatives expériences statistiques de SMF, idéalement une seule et même molécule est utilisée sur toute la durée de l'expérience. Contrairement aux expériences avec des ensembles de molécules, des expériences SMF sont capables de détecter des événeme…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank the DFG (Hu 997/2-2) for financial support. FS acknowledges the Hanns-Seidel-Stiftung (HSS). SKr was supported by the Elitenetzwerk Bayern in the framework of the doctorate program Material Science of Complex Interfaces. SKi thanks the SFB 863 for financial support.
Materials
| Materials | |||
| Hellmanex III alkaline liquid concentrate (detergent solution) | Hellma | ||
| RCA (ultrapure water, hydrogen peroxide (35 %), ammonia (32%); 5:1:1(v/v/v)) | Sigma | ||
| Vectabond reagent / APTES (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Vectorlabs | ||
| Dry acetone (< 50 ppm H2O) | Sigma | ||
| Dry chloroform (> 99.9 %) | Sigma | ||
| Triethylamine | Sigma | ||
| Ultrapure water | Biochrom, Germany | ||
| Di-sodium tetraborate (> 99.5 %) | Biochrom, Germany | ||
| Boric Acid | Biochrom, Germany | ||
| Monofunctional α-methoxy-ω-NHS PEG, 5kDa, “methyl-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Heterobifunctional α,ω-bis-NHS PEG, 6 kDa, “NHS-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Heterobifunctional α-maleimidohexanoic- ω-NHS PEG, 5 kDa, “Mal-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Probe molecule (polymer, lipid, etc.) | |||
| Equipment | |||
| Sufficient amount of glass crystallising dishes with spout (10 ml), glass petri dishes (500 µl) and glass lids | VWR International GmbH, Germany | ||
| Laboratory oven model UF30 | Memmert, Germany | ||
| Temperature controlled sonicator | VWR International GmbH, Germany | ||
| Plasma system "Femto", 100 W | Diener, Germany | ||
| One separate glass syringe for each organic solvent | VWR International GmbH, Germany | ||
| Vortex mixer | VWR International GmbH, Germany | ||
| Microcentrifuge tubes (0.5 ml or 1.5 ml) | Eppendorf | ||
| Pipettes: 10-100 µl, 50-200 µl and 100-1000 µl | Eppendorf | ||
| AFM with temperature controlled fluid cell (e.g. MFP-3D with BioHeater) | Asylulm Research, Santa Barbara | ||
| Soft SiN cantilevers cantilever, typically made from silicon nitride (SiN) (spring constant less than 100 pN/nm, e.g. MLCT) | Bruker AXS, Santa Barbara |
Riferimenti
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