난소 암 종양 시작 세포의 생체 농축에

난소 암 세포주 1. 전통 문화 (점착 조건) 참고 : 세포와 미디어의 모든 처리는 멸균 조직 문화 후드에서 개최한다 기존의 세포 배양 배지를 준비합니다. 한 DMEM : 1 사용 F12 (+ L 글루타민, 15 mM의 HEPES +)를 10 % 열 불 활성화 소 태아 혈청과 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 보충. 0.45 μm의 진공 필터를 사용하여 필터 솔루션입니다. interest.Remove의 세포주 매우 낮은 냉동 또는 액체 질소에서 세포의 유리 병의 전통적인 이름, 날짜 표시 폴리스티렌 75cm 두 조직 배양 플라스크와 통로 수를 준비합니다. 5 분 동안 37 ℃의 수욕에 놓아 제상. 3 ㎖를 (상기 제조 됨) 기존의 세포 배양 배지를 함유하는 15 ml의 원심 분리 튜브에 바이알로부터 전송 현탁액. 400 x g에서 5 분 동안 4 ° C에서 원심 분리기 서스펜션. 한편, 플라스크에 16 ml의 전통적인 세포 배양 배지를 추가합니다. 대기음 뜨는. 펠렛 및 전송 현탁액 플라스크 데 풀어 위아래로 2 ml의에게 기존의 세포 배양 미디어 피펫 세포를 사용. 조심스럽게 바위 플라스크에 균등하게 37 ° C, 5 % CO 2로 설정 가습 세포 배양 인큐베이터에서 cells.Place 플라스크를 배포합니다. 80 % 합류에 도달 할 때까지 세포를 매일 모니터한다. 이 세포 배양 후드 : 일단 세포가 80 % 컨 플루 언트 한 배양을 분할. 기음 뜨는 (칼슘과 마그네슘없이) 따뜻한 인산염 완충 생리 식염수로 씻어 (PBS). 1.5 ml의 트립신 0.25 %의 -EDTA를 추가하고, 실온에서 3 ~ 5 분을 품어. 이 새로운 폴리스티렌 75cm 2 플라스크를 준비하고 각각의 플라스크에 16 ml의에게 기존의 세포 배양 배지를 추가합니다. 새로운 플라스크 각각에 4 ㎖의 전통적인 세포 배양 배지와 같은 부피의 분취 세포를 트립신으로 재현 탁. 가습 세포 배양 인큐베이터에 넣어 플라스크는 37 ° C, 5 % CO 2로 설정. 80 % 합류에 도달 할 때까지 세포를 매일 모니터한다. 세포를 분리하기 위해 계속-80에서 액체 질소의 문화 또는 동결 및 저장. 부동 또는 부착 세포를 사용하여 난소 암 세포주에서 다세포 타원체의 2 세대 참고 : 세포와 미디어의 모든 처리는 멸균 조직 문화 후드에서 개최한다. 2 전통 문화 방법에서 세포주를 배양 한 후 – 3 통로 (섹션 1) 다음 단계를 진행합니다. 줄기 세포 미디어를 준비합니다. 한 DMEM : F12 (+ L 글루타민, + 15 mM의 HEPES) 및 1 % 녹아웃 혈청 교체 (100 U의 최종 농도 / ㎖ 페니실린 및 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신) 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 보충 한 사용 0.4 % 소 혈청 알부민 및 0.1 % 인슐린 – 트랜스페린 – 셀렌. 0.45 μm의 진공 필터를 사용하여 필터 솔루션입니다. 20 NG / ml 내지 10 N의 최종 농도를위한 재조합 인간 상피 성장 인자 (EGF) 및 인간 재조합 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (FGF)와 보충 줄기 세포 매체g / ㎖, 각각. 주 : 성장 인자는 사용 전에 바로 줄기 세포에 신선한 미디어를 첨가한다. 플로터 TIC 문화를 만듭니다. 전통 부착 배양 조건에서 재배 80 % 융합 세포의 플라스크를 제거합니다. 뒤에 부착 인구를 떠나, 미디어 및 모든 부동 세포 (단일 및 집계)를 수집, 50 ml의 폴리 프로필렌 원심 분리 관에 전송할 수 있습니다. 400 x g에서 5 분 동안 4 ° C에서 원심 분리기 서스펜션. 주 : 부동 세포 응집체 명백 24-72 시간을 접착 세포 배양은 전통적 하에서 플라스크 접합 후의. 약 1.0의 80 % 융합 성 플레이트 검색 최저 – 5.0 × 10 5 가능한 부유 세포 세포주에 따라 예상 될 수있다. 본 연구에서는 80 % 합류 접착 배양 물로부터 수집 부유 세포 수의 평균은하기와 같다 : OVCAR5 5.0 ACI-23, 4.8 대 × 105 × 105, CAOV3 3.5 × 105, 및 TGS- 1.0 × 105 3. 전송시, 멀티 셀이 다소 세포주에 의존하지만 전통과 플로터 TIC 문화 울라 회전 타원체의 형성은 몇 일 이내에 발생합니다. 예를 들어, ACI-23 세포 응집체보다 더욱 용이 CAOV3 세포를 형성한다. 한편, 이름, 날짜 및 세포주의 통로 번호로 라벨링 초저 부착면 폴리스티렌 75cm 2 조직 배양 플라스크를 준비한다. 플라스크에 성장 인자 보충 세포 미디어 줄기 ㎖로 (10)를 추가합니다. 원심 분리 펠렛을 풀어 아래로 세포 미디어 줄기 ㎖로 6를 추가하고 피펫 팅에 의해 낮은 부착 플라스크에 완료, 기음 미디어 및 전송 펠릿되면. 가습 세포 배양 인큐베이터에 넣어 플라스크는 37 ° C, 5 % CO 2로 설정. 회전 타원체 형성을 관찰 3 일 – 매 2 세포를 모니터링합니다. 기존 TIC 문화를 만듭니다. 전통 부착 배양 조건에서 재배 80 % 융합 세포의 플라스크를 제거합니다. 기음 미디어와 따뜻한 PBS로 세척한다. 1.5 ml의 트립신 0.25 %의 EDTA를 추가하고 배양 3-5RT에서 분. 이름, 날짜 및 세포주의 통로 번호로 라벨링 초저 부착면 폴리스티렌 75cm 2 조직 배양 플라스크를 준비한다. 플라스크에 설명 된 바와 같이, EGF와 FGF 보충 세포 미디어, 줄기, 10 ㎖를 추가합니다. 트립신과 플라스크에 세포 미디어 줄기 ㎖로 추가 6. 피펫 셀 솔루션은 상하 플라스크 표면에서 세포를 풀어 시도합니다. 세포의 전체 볼륨을 이동 (10)는 세포 미디어 줄기 ㎖로 포함 된 초저 부착 플라스크에. 가습 세포 배양 인큐베이터에 넣어 플라스크는 37 ° C, 5 % CO 2로 설정. 각각 ml의 20 NG / 최종 농도가 10 ng를 / ㎖에 대한 세포 매체와 신선한 EGF와 FGF 줄기 ㎖로 추가 2 72 시간 – TIC 문화마다 48 보충. 80 %의 합류에 도달 – 60까지 셀을 모니터링합니다. 이 새로운 초저 부착 플라스크에 같은 부피를 배치하고 18 ㎖의 최종 부피를 달성하기 위해 신선한 줄기 세포 매체를 첨가하여 분할 배양. 선택적인LY, 원심 분리기 400 x g에서 5 분 동안 4 ° C에서 전체 서스펜션. 줄기 세포 미디어 재현 탁 세포는 EGF와 FGF 보충하고 새로운 초저 부착 플라스크에 동일하게 배포 할 수 있습니다. 세포는 계대에 대한 단일 세포 현탁액으로 해리 할 필요가 없습니다. 참고 :이 시점에서 문화는 분리 배양, 냉동, 또는 실험적으로 분석 조작을 계속할 수 있습니다. 60 – 80 %의 합류 세포의 다음과 같은 농도는 ACI-23에 대해 검색했다 : 8.0 전통 자기편에 대한 × 10 (6), 전통 TIC 4.0 × 10 6, 플로터 TIC 문화 5.0 × 10 (6). 이 세포주 의존 할 수 있지만, 우리는 5 것으로 나타났습니다 – 문화에서 10 일 CD133 + ALDH + 세포의 비율로 TIC 농축을위한 최적의 처음 3 일 이내에 낮고, 5 봉우리 – 10 일, 그리고 다시 감소 십사일. 차 상피 난소 암 세포주 및 다세포 회전 타원체의 3 세대Chemoresistant 환자 복수에서 참고 : 심사위원회 (Institutional Review Board)의 승인이 프로토콜에 대한 얻었다. 세포와 미디어의 모든 처리는 멸균 조직 문화 후드에서 개최한다. 기존의 세포 배양 배지와 1 : 1 유체 플레이트 복수. 1 절에 설명 된대로 미디어를 준비하고 여러 전통 폴리스티렌 75cm 두 조직 배양 플라스크에 10ml를 추가합니다. 복수 액은 일반적으로 1 L 멸균 진공 병에 제공된다; 진공 캡을 제거합니다. 조심스럽게 37 ° C, 5 % CO 2로 설정 가습 세포 배양 인큐베이터에서 10 ml의 전통적인 미디어와 장소를 포함 플라스크에 액체 10 ml의 복수를 추가합니다. 전체 미디어의 변화를 수행하기 전에, 96 시간 – 72 방해받지 둡니다. 80 % 합류 – 세포가 60에 도달 할 때까지 3 일 – 매 2 미디어 변경 2 절에 설명 된대로 섹션 1. TIC 문화에 설명 된대로 2 : – 세포가 60에 도달하면 80 %의 합류, 1 분할. 참고 : ascit에 존재하는 적혈구그들은 비 부착만큼 ES는 최초의 미디어 변경 후 제거됩니다. 그들은 더 민감하고 트립신에 최소한의 노출로 올라옵니다으로 존재하는 섬유 아세포 크게 트립신 처리 후 제거됩니다. 난소 암 세포의 순도는 CA-125 (MUC16)에 대한 항체를 사용하여 유세포 분석으로 측정 하였다. TIC 마커의 유동 세포 계측법 확인을위한 세포의 4. 염색 TIC 문화를 수집합니다. 50 ml의 폴리 프로필렌 원심 분리 관에 플라스크의 내용을 전송합니다. 400 x g에서 5 분 동안 원심 분리기 현탁액. 기음 미디어와 따뜻한 PBS로 세척한다. 대단히 짧은 시간을 깨고 하나의 세포로 해리 아래로 37 ° C에서 5 분, 최대 피펫과 -, 2 ml의에게 비 효소 세포 분리 솔루션을 추가 3 품어. 세포 미디어 줄기 ㎖로 4를 추가합니다. 자기편 문화를 수집합니다. 기음 미디어와 따뜻한 PBS로 세척한다. 3 ㎖에게 비 효소 세포 분리 솔루션을 추가하고 3 부화 – 37 ° C에서 5 분. 기존의 세포 3 ML을 추가문화 미디어는 최대 피펫 반복 아래 플라스크에서 세포를 분리하는 원심 분리기 튜브에 수집합니다. 원심 분리기 TIC 400 x g에서 5 분 동안 부착 현탁액 모두. 상등액을 버리고 3 % 소 태아 혈청을 함유하는 1 ml의 PBS에 재현 탁 각 펠릿. RT 30 분에 품어. 한편, 트리 판 블루를 사용하여 가능한 세포의 수를 계산합니다. 타원체가 하나의 세포로 해리 확인하기 위해 현미경으로 세포를 관찰합니다. 보상 1) 흠을 (흠없는 제어) 보상, 2) ALDH (단일 얼룩 양성 대조군) 보상, 3) CD133을 (단일 얼룩 양성 대조군), 4 : 다음 배양 조건의 각 라벨 5 X 1.5 에펜 도르프 튜브 ) ALDH + CD133 (실험 시료), 5) FL-1, FL-4 채널, 각각)에서 DEAB + ALDH (형광 배경에 대한 부정적인 제어합니다. 400 × g으로 5 분 동안 원심 분리기 (4) 서스펜션 – 튜브 # 1~ 약 5 × 105 세포에 각각 분배. 기음 supernata500 μL Aldefluor 분석 버퍼에서 NT 및에 resuspend 펠렛. 실험 부정적인 제어 튜브 # 5에 10 μL의 DEAB (ALDH 억제제)를 추가합니다. 보상 양성 대조군과 혼합하는 영화에 대한 관 # 2에 Aldefluor 시약 활성화 5 μl를 추가합니다. 실험 분석을 위해 튜브 # 4 Aldefluor 시약 활성화 5 μl를 추가합니다. 톡 튜브를 혼합하고 즉시 DEAB을 포함 튜브 # 5 (250 μL)에 튜브 # 4에서 세포의 절반 볼륨을 전송합니다. 톡 튜브는 잘 혼합합니다. 빛으로부터 보호 37 ° C에서 45 분 – 30에 대한 모든 튜브를 품어. 톡 튜브의 중간 잠복기를 통해 세포가 바닥에 닿고있다. 원심 분리기 400 x g에서 5 분 동안 모든 튜브. 500 μL Aldefluor 분석 버퍼에 기음 뜨는에 resuspend 세포. CD133 염색과 튜브 (# 3, # 4), 직접 Aldefluor 분석 버퍼에 CD133-APC 1:11 추가합니다. 빛으로부터 보호 얼음에 15 분을 품어. 400 x g에서 5 분 동안 원심 분리기 CD133 튜브. 한 번 세척분석 완충액 500 μL Aldefluor. 각각 500 μL Aldefluor 분석 완충액에 재현 탁 세포. 셀 스트레이너 캡 개별 폴리스티렌 원형 바닥 튜브에 필터 현탁액. 전체 볼륨 캡을 통해 여과되어 있는지 확인합니다. 세포 집단을 분석하는 플로우 사이토 미터를 사용한다. 보상 제어를 설정하는 튜브에게 # 1-3를 사용합니다. 세포 파편을 제외해야되고, 세포를 앞으로 사용 및 측면 산란 매개 변수, 게이트. ALDH +와 CD133 + 각각 FL-1, FL-4 채널을 사용하여 두 번 세포를 설정합니다. 유세포 분석 프로그램을 사용하여 배양 조건이 두 마커 높은 염색 있어야 TIC 풍부한 배양 등 TIC 세포의 비율을 향상 확인. 참고 : CD133 및 ALDH 외에 다른 markersof 난소 암 틱은 유동 세포 측정기의 성능에 의존하는 임의의 하나의 샘플에 사용 된 마커들의 수와 분석 될 수있다. 5. 생체 내 </em>는 피하 주사는 세포 인구의 발암을 확인하기 참고 : 심사위원회 (Institutional Review Board)의 승인이 프로토콜에 대한 얻었다. 3 케이지의 실험 그룹으로 세 8 주 및 주사하기 전에 며칠 동안 적응 할 수 있도록 – 흉선 여성 누드 마우스 (6)를 배포합니다. NIH 동물 관리 및 사용위원회에 따라 인도적인 실험 지침에 따라 마우스를 따라; 체중 감소 또는 20 % 이상을 확보, 수척 외관, 설사 피부염 체중, 신체적 외모를 모니터링 및 CO 2 질식에 의해 이러한 기준에 맞는 마우스를 안락사. 1 ml의 PBS에서 2 절 재현 탁 각각의 세포 집단에 설명 된대로 문화를 수집합니다. 트리 판 블루 분석법을 이용하여 가능한 세포를 계산합니다. 15 ml의 원심 분리기 튜브를 준비합니다. 중으로 대책 각 튜브에 2 ml의 PBS 중에 희석 1.5 × 106 생세포를 추가 (0.5 ml의 부피의 5 × 105 세포를 피하 주입 F 오른쪽 될각 마우스의 여윈). 만 제어 마우스 0.5 ml의 PBS를 준비합니다. 27 G 바늘을 사용하여, 그룹 당 3 마우스의 각각의 오른쪽 측면에 TIC 문화를 뜨는 또는 PBS, 전통 부착 문화, 전통 TIC 문화에서 0.5 ml의 세포 현탁액을 subcutaneouslyinject. 원래 케이지 포스트 분사에 마우스를 돌려줍니다. 마우스 무게와 길이와 폭을 수립, 버니어 캘리퍼스 weeklyby 두 번 두 차원에서 어떤 만져서 알 수있는 종양을 측정한다. 주 : 종양 대기 시간은 일반적으로 20 – 세포주에 따라 50 일. 표준 방법 (V = (폭) 2 × 길이 / 2)에 의해 종양 젖은 볼륨을 계산합니다. 참고 :이 연구는, 유사한 조건 하에서 성장 틱의 생체 시리얼 계대가 다른 11,20에 의해 완성 된 첫 번째 세대에 대한 부착 세포 대 틱의 발암를 비교하지만.