대 식세포 콜레스테롤 고갈과의 식균 작용에 미치는 영향<em> 크립토 콕 쿠스 네오 포르</em
Summary
In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.
Abstract
크립토는 속 크립토의 병원성 곰팡이에 의해 발생 생명을 위협하는 감염입니다. 감염 깊은 폐에 복제 할 수 포자의 흡입에 발생합니다. 크립토 식세포의 탐식 수막뇌염 치명적인 질병을 일으키는 중추 신경계로 확산 할 수있는 방법 중 하나이다. 따라서, 크립토 식세포 간의 관계에 대한 연구는 감염의 진행을 이해하는 것이 중요하다. 본 연구는 C.에 의해 대식 세포 감염을 연구하는 단계별 프로토콜을 설명합니다 체외에서 콕 쿠스 네오 포르 만. 이 프로토콜을 이용하여, 호스트 – 호스트 상호 작용에 대한 병원체 스테롤 역할이 검토되고있다. 상이한 농도의 메틸 – 시클로 덱스트린 (MCD)는 뮤린 세망 육종 식세포 같은 세포주 J774A.1에서 콜레스테롤을 고갈하는데 사용되었다. 콜레스테롤 고갈을 확인하고 시판 availabl를 사용하여 두 정량전자 콜레스테롤 정량 키트 및 박층 크로마토 그래피. 콜레스테롤 세포 고갈 Lipopolysacharide (LPS) 및 인터페론 감마 (IFNγ)를 사용하여 (1)의 활성화 및 이펙터 대 표적 비율 항체 – 옵 소닌 크립토 콕 쿠스 네오 포르 만 스 야생형 H99 세포를 감염시켰다 1. 감염된 세포는 C.와 배양 2 시간 후 관찰 하였다 콕 쿠스 네오 포르 만 그들의 균성 지수를 계산 하였다. 콜레스테롤 고갈 식세포 인덱스 상당한 감소 결과. 제시된 프로토콜은 실험실 환경에서 악성 프로세스의 개시를 모방하고 감염성 숙주에 지질 조성물의 역할을 연구하기에 편리한 방법을 제공한다.
Introduction
탐식 세포 외 실체가 숙주 세포에 의해 내재화되는 과정입니다. 또한 병원균에 대한 방어 면역 체계의 병기 키 무기이지만, 프로세스는 종종 내재화 및 본체 (1) 전체에 확산을 허용하도록 병원균 전복 될 수있다. 탐식 숙주 세포의 세포 골격 재 배열을 통한 부착과 말림을 초래할 여러 시그널링 이벤트에 의해 매개된다. '전문'식세포는 첨부 파일과 병원균을 삼켜과 phagosome 2를 형성 멜리의 형성에 대한 신호를 침입 병원균의 표면에 opsonins로 인식하고 결합 할 수 있습니다. 소위 '전문가'식세포 중 대 식세포이다. 대 식세포는 대부분의, 추구와 질병의 원인이 에이전트를 제거, 손상된 조직을 복구 및 염증을 매개하는 등 보호 기능을 수행 고도로 전문화 된 세포이다식균 작용 1,2의 과정을 통해 이들.
크립토 콕 쿠스 네오 포르 만은 크립토로 알려진 심각한 질병을 일으키는 병원성 효모의 종입니다. 크립토 포자는 호스트에 의해 흡입 일반적으로 무증상 폐 감염이 발생할 수 있습니다. 노광이 매우 만연이라고 사료된다; 조사 된 모든 사람들은 크립토 다당류 glucuronoxylomannan 및 다른 연구에 대한 항체를 가지고 있다는 클리닉 브롱스 레바논 병원 센터에서 발견 된 소아 감염성 질환 61 어린이의 샘플은 모두 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 감염되지 않은 감염된 성인 3 유병률을 보여 주었다 4. 폐포 대 식세포가 성공적으로 명확 병원체 폐 감염에 대부분의 경우 응답의 첫 번째 줄입니다. 그러나, 면역 개인 (예를 들면, HIV 및 AIDS 환자)에 효모는 대 식세포 내에서 생존 할 수있다. 이들에이 경우, 대 식세포는 병원체의 복제 틈새의 역할을 할 수 있으며 5 치명적인 질병해진다 중추 신경계 (CNS)의 보급에 용이하게 할 수있다 – 8. 11 – 그것은 식세포 심지어 "트로이 목마"모델 3,9- 통해 혈액 뇌 장벽을 통과하는 효모 돕는 수막에 직접 효모를 전달할 수 있다고 생각된다. 따라서, 탐식 과정과 특히 크립토 감염에 영향을 끼치는 요인을 이해하는 것이 중요하다.
15 – 다른 병원체 시스템의 이전 작업은 식균 작용 (12)에 중요한 역할을 갖는 것으로 콜레스테롤에 의해 형성 콜레스테롤과 지질 뗏목을 가리 킵니다. 콜레스테롤은 포유 동물 세포에 가장 풍부한 지질 종 및 25 포함 – 포유류 세포 막 (16)의 50 %. 그것은 BIOP를 변조하는 역할을하는 것으로 밝혀졌다자신의 강성 (17)을 변경하여 막 A. 물리적 특성. 콜레스테롤과 스핑 고리 피드 함께 지질 뗏목으로 알려진 막 내 지질 마이크로 도메인을 형성한다. 18 – 지질 래프트은 카베 올래의 형성뿐만 아니라, 신호 (16)의 특정 유형에 대한 격리 영역을 제공하는데 관여하는 것으로 밝혀졌다. 그들의 작은 크기 때문에, 이것은 생체 내에서의 지질 래프트를 연구하기가 어렵다. 지질 래프트의 역할을 연구하기위한 유용한 방법은 성분을 변경하는 것이다. β 메틸 시클로 덱스트린 (MβCD)는 포유류 막으로부터 콜레스테롤을 고갈 밝혀졌다 일반적 지질 래프트 (18)의 역할을 연구하기 위해 사용되는 화합물이다.
이러한 프로토콜에서는, 숙주 세포 막으로부터 콜레스테롤을 고갈 및 C.를 탐식하는 숙주 세포의 능력 고갈의 효과를 정량화하는 방법을 제시 체외에서 콕 쿠스 네오 포르 만. 이 절차는 세포 배양 techniq 이용한다감염 모델로 세포주 (J774A.1) 같은 불멸의 대 식세포에 단말. 콜레스테롤 고갈 스테롤의 크기에 특정 소수성 코어를 가지고 있으며, 콜레스테롤 막 (19) 밖으로 묘화하는 싱크 역할을 할 수 MβCD에 노출에 의해 이루어졌다. 콜레스테롤 고갈 정량적 시판 키트를 사용하고 질적으로 박층 크로마토 그래피 (TLC) (20) 다음에 수정 된 후 Bligh-다이어 지질을 추출하여 측정 하였다. . (23) – 탐식은 대 식세포를 활성화하기위한 인터페론 γ 및 리포 폴리 사카 라이드의 칵테일 혼합 옵 소닌 효모의 문화 세포주를 감염에 의해 측정 된 크립토는 glucuronoxylomannan (GXM) 항체 (21)를 사용하여 옵 소닌했다. 염색 현미경 실험은 식균 작용의 정도를 평가하기 위해 세포를 시각화 및 포식성 지수 계산을 허용했다. 이 프로토콜 D, 함께 촬영생리적 과정 지질 조성의 변화를 통합 기본적인 방법 escribes.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜과 협력 이는 포유류 세포를 C. 도금 및 opsonizing 때 정확한 세포 수를 구하는 것이 중요 콕 쿠스 네오 포르 셀. 이 시험 사이의 변화를 최소화하고 정확한 일 보장 : 연구를 통해 이펙터 비율 1 목표. 또한 절차 사이에 RT에서 휴식에서 옵 소닌 효모 세포 또는 처리 된 대 식세포를 방지 콜레스테롤 고갈과 감염의 타이밍을 조정하는 것이 중요하다. 감염이 시작하기 전에 긴 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH 보조금 MDP에 AI56168, AI71142, AI87541 및 AI100631에 의해 지원되었다. 마우리 치오 델 포에 타는 감염증에 버로우즈 웰컴 탐정이다.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Class II type A2 Biosafety Cabinet | Labconco | 3460009 | |
| J774A.1 cell line | ATCC | TIB-67 | Arrives Frozen. See ATCC instructions for culturing. |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | 11995-065 | Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use |
| HI Fetal Bovine Serum Performance Plus | Gibco | 10082-147 | Keep frozen at -20 °C and thaw before adding to DMEM |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | Used to suplement DMEM |
| Isotemp Cell culture incubator | Fisher Scientific | Model # 3530 | |
| 96-Well culture dish | Corning Inc. Costar | 3595 | |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific BioReagents | BP3994 | Dilute to 1x and filter or autoclave prior to use. |
| Methyl-β-Cyclodextrin | Sigma Life Science | C4555-10G | Dissolve in 1x PBS to make solutions of 10mM and 30mM concentrations |
| Orbital Shaker | Labline | ||
| Amplex Red Cholesterol Assay Kit | Life Technologies Molecular Probes | A12216 | All reagents for Cholesterol Assay are contained within the kit. Follow Manufacturer instructions. |
| 96-Well Black Assay plate | Corning Inc. Costar | 3603 | |
| FilterMax microplate reader | Molecular Devices | Model F5 | |
| TLC Chamber | Sigma-Aldrich | Z126195-1EA | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 650498-4L | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-2L-R | |
| TLC Paper | Whatman | 3030917 | Cut down to size needed for TLC tank |
| Fume Hood | Any fume hood that complies with AIHA/ANSI Standards | ||
| 6-Well Plate | Corning Inc. Costar | 3506 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Cell Scraper | Corning Inc. Costar | 3010 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Model Alegra x-30R | |
| Votex Mixer | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Balance | Mettler Toledo | Model # MS104S Meaures down to .1 mg | |
| Glass Pasteur Pipette | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000 | |
| SpeedVac Concentrator | Thermo Scientific | Model # SPD2010 | |
| Petroleum Ether | Fisher Scientific | E139-1 | |
| Diethyl Ether | Sigma-Aldrich | 309966 | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| TLC Silica Gel 60 with concentrating zone | Analytical Chromatograhy Millipore | 1.11845.0001 | |
| Iodine Chips | Sigma-Aldrich | 376558-50G | |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| Manganese Chloride | Sigma-Aldrich | 244589 | |
| UVP EC3 Imaging System | Ultra-Violet Products Ltd. | Use the Vision Works LS software for densitometry analysis | |
| Glass Bottom Confocal Dish | MatTek | P35G-1.5-10C | www.glassbottomdishes.com |
| Cryptococcus neoformans (H99) | Obtained from Duke University Medical Center | ||
| YNB | BD | 239210 | See manufacturer for preparation instructions. Use a Glucose concentration of 20 g/L. |
| Lipopolysaccharide | Sigma | L4391-1MG | Dissolve in 1x PBS to make 1mg/mL stock. Store at -20 °C. |
| Interferon gamma | Sigma | I4777 | Dissolve in 1x PBS to make .1 mg/mL stock solution |
| Glucuronoxylomannan antibody (anti-GXM) | Gift from Arturo Casadevall's Lab concentration is 1.98 mg/mL | ||
| Giemsa | MP Biomedicals | 194591 | Dissolve .8 g of Giemsa in 25 mL of Glycerol and heat to 60 °C for 1 hour. Add 25 mL of methanol to the solution and allow to age at room temperature for at least 1 month. |
| Microscope | Zeiss | Observer.D1 microscope with AxioCam MRm for taking images |
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