Un dosage colorimétrique qui mesure spécifiquement l'activité protéolytique Granzyme B: hydrolyse de Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl
Summary
We describe a simple, quantitative colorimetric assay that specifically measures the proteolytic activity of human, mouse or rat Granzyme B (GzmB). This protocol can be easily adapted for determining protease activity of other granule serine proteases by the hydrolysis of other synthetic peptide substrates with an appropriate recognition sequence.
Abstract
The serine protease Granzyme B (GzmB) mediates target cell apoptosis when released by cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells. GzmB is the most studied granzyme in humans and mice and therefore, researchers need specific and reliable tools to study its function and role in pathophysiology. This especially necessitates assays that do not recognize proteases such as caspases or other granzymes that are structurally or functionally related. Here, we apply GzmB’s preference for cleavage after aspartic acid residues in a colorimetric assay using the peptide thioester Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. GzmB is the only mammalian serine protease capable of cleaving this substrate. The substrate is cleaved with similar efficiency by human, mouse and rat GzmB, a property not shared by other commercially available peptide substrates, even some that are advertised as being suitable for this purpose. This protocol is demonstrated using unfractionated lysates from activated NK cells or CTL and is also suitable for recombinant proteases generated in a variety of prokaryotic and eukaryotic systems, provided the correct controls are used. This assay is a highly specific method to ascertain the potential pro-apoptotic activity of cytotoxic molecules in mammalian lymphocytes, and of their recombinant counterparts expressed by a variety of methodologies.
Introduction
Granzymes sont une famille de sérine-protéases présentes dans les lysosomes sécrétoires de cellules tueuses naturelles (cellules NK) et de lymphocytes T cytotoxiques (CTL) 1. Cinq granzymes différentes existent chez l'homme (A, B, H, K et M), et dix chez les souris (A – G, K, M et N) 2,3. Granzyme A et granzyme B (GZMA, GZMB) sont les plus abondants et ont été largement étudiées dans le contexte humain et de rongeur.
La fonction classique de GZMB est l'induction de l'apoptose dans des cellules cibles exécutées en conjonction avec la perforine protéine formant des pores, ce qui permet d'accéder à la granzyme cytosol de la cellule cible 4. Bien que l'expression GZMB est sans équivoque trouvée dans les lymphocytes cytotoxiques, des études récentes se sont penchés sur une variété d'autres types de cellules GZMB exprimant, y compris, mais sans s'y limiter, les kératinocytes 5, basophiles 6, les mastocytes 7, les cellules dendritiques plasmacytoïdes 8, et les cellules B 9, 10.Dans ce contexte, les fonctions de GZMB non apoptotiques ont été révélés allant de participation dans les processus inflammatoires, le remodelage des tissus et d'autres propriétés immunorégulatrices 11-14.
Étant donné qu'un rôle biologique plus large a été proposé pour GZMB qu'on ne le pensait, les chercheurs ont besoin d'outils fiables et spécifiques pour sa détection. L'avantage est de GZMB exigence spécifique pour cliver du côté carboxylique de résidus acide aspartique, une propriété unique parmi les serine proteases eucaryotes 15. Souris, humaines et GZMB de rat sont structurellement très similaires, mais la spécificité de substrat étendu de GZMB de souris diffère légèrement de celle de fois humaine et de rat 16, ce qui signifie que certains substrats génériques avec Asp à la borne (P1) peuvent être clivées efficacement par GZMB des trois espèces, alors que d'autres substrats avec des séquences plus complexes amont de P1 peuvent donner des résultats très variables. Dans le passé et li plus récenteterature, ce fait a causé de la confusion et une mauvaise interprétation de la signification biologique de certains résultats expérimentaux considérables, même si soigneusement contrôlée, des études cinétiques ont cherché à corriger la situation 17.
Dans cet article, nous avons cherché à illustrer ces points en utilisant deux substrats disponibles dans le commerce, à savoir Boc-Ala-Ala-Asp-SBzl et N-acétyl-Ile-Glu-Pro-Asp-p-nitroanilide. Les deux réactifs faire générer différents groupes réactifs après le clivage (un sulfhydryle libre par rapport à un paranitroanilide gratuitement fluorescent), mais cela n'a aucun effet sur le clivage protéolytique. Le protocole décrit est une adaptation moderne d'un protocole très vieux 18, mais devrait aider les enquêteurs à utiliser les différents substrats de GZMB appropriée, tout en fournissant un cadre méthodologique pour détecter l'activité d'autres granzymes, comme GZMA et GzmH.
Protocol
Representative Results
Discussion
Historiquement, les granzymes ont été identifiées en tant que molécules effectrices clés de lymphocytes cytotoxiques (cellules CTL et NK) capables d'induire une mort par apoptose rapide dans les cellules cibles. Ce est principalement due à l'action de GZMB, qui clivé molécules de substrat cibles au aspartate (D) résidus et a pu activer la cascade des caspases par les deux clivage pro-caspases, ainsi que plusieurs de leurs cibles en aval ainsi. Cependant, il est maintenant reconnu que les GZMB expression…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work received support through grant HA 6136/1-1 from the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) to MH. JAT is supported by Program and Project Grants from the National Health and Medical Research Council of Australia.
Materials
| Product | Company | Catalogue number | Comment/description |
| Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl | SM Biochemicals LLC, CA | SMSB05 | Granzyme B substrate (mouse and human) |
| Ac-IEPD-pNA | SM Biochemicals LLC, CA | SMPNA009 | Granzyme B substrate (only human) |
| N-a-CBZ-L-lysine-S-Bzl | Sigma-Aldrich | C3647 | Granzyme A substrate |
| Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl | SM Biochemicals LLC, CA | SB025 | Granzyme H substrate |
| 5,5’-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) | Sigma-Aldrich | D8130 | DTNB, Ellman’s Reagent |
| NK cell isolation kit II mouse | Miltenyi Biotec GmbH | 130-096-892 | negative selection kit |
| NK cell isolation kit human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-092-657 | negative selection kit |
| Plate reader | Biorad iMark | Biorad Microplate Manager Software Version MPM6.3 | |
| Serocluster U-bottom vinyl 96-well plate | Corning, MA, USA | 2797 |
Riferimenti
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