실험 녹내장은 안구하는 미소 자석을 투여 한

윤리 문 : 모든 동물 실험 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 따라 수행되었으며, 영국 홈 오피스 가이드 라인에 동의 (승인했다 http://goo.gl/FLkirW는 지난 10 일 6 월 액세스 2014) 및 안과 및 비전 연구 (에서 동물의 사용을위한 ARVO 문 http://goo.gl/4LFOjD는 지난 10 일 6 월 2014) 액세스. 1. 안구 고혈압 유도 Samsel 등의 방법에 따라, 갈색 노르웨이 쥐의 전방에 상자성 미소의 일방적 인 주입을 통해 안압 (IOP)를 올려서 실험 녹내장을 유도한다. 이러한 검증 할 필요가 있지만 3 기타 색소 쥐, 적합 할 수있다 사용자가 처음. 하우스 250-300의 g 여성일정한 낮은 조명 환경 (40 ~ 60 룩스)에서 전 개종 갈색 노르웨이 쥐 물과식이에 액세스 할 수있는, IOP 7 일중 변동을 최소화합니다. 쥐의 눈 (9)에 사용하기 위해 교정 리바운드 안압계를 이용하여, 이전에 마취 구슬 주입에 깨어 동물 8 기준 안압 측정을 수행. IOP는 다섯 개의 측정 값의 평균으로한다. 복강 전달 37.5 ㎎ / kg 케타민, 0.25 ㎎ / ㎏ medetomidine 염산염 쥐를 마취시키다. 동물의 뒷발 반사를 테스트함으로써 마취 깊이를 확인, 요오드 애플리케이션 (단계 1.5 참조), 비드 포비돈을 주입하기 전에 (단계 1.8 참조). 진통제 0.5 % proparacaine 염산염을 관리합니다. 참고 : 모든 단계에서 동공을 팽창하지 마십시오. 이 구슬은 홍채 각막 각도로 잘 정착하는 데 도움이 렌즈에 결합하는 것을 방지 할 수 있습니다. 수술하지 않은 반대편 눈에 각막 건조를 방지하기 위해 눈 연고를 적용합니다. W물에 주입하기 전에 10 5 분을 5 % 포비돈 요오드와 수술 눈 화산재. 5 분 후, 멸균 거즈을 개시 포비돈 요오드 심지, 0.9 % 멸균 식염수로 눈을 씻는다. 멸균 식염수의 일반 응용 프로그램과 마취 동안 촉촉한 눈을 유지합니다. 눈 주위에 도넛 자석을 배치합니다. 33 G 바늘을 이용하여 경 사진 30 ㎎ / 전방에 행크의 균형 잡힌 염 용액 (HBSS)에 8 ㎛의 자성 마이크로 감마 멸균 ml의 조사를 함유하는 용액 25 ㎕를 주입한다. 구슬을 준비하려면, 다음 최종 30 ㎎ / ㎖ 솔루션을하기 전에, 1 ml의 HBSS 5 분 동안 10,000 XG에서 3 회 원심 분리, 다시 현탁하여 세척한다. 전체에서 무균 조건을 유지한다. 주사를 들어, 홍채 외상의 위험을 최소화하기 위해, 홍채에 바늘을 삽입하지 않도록주의해야합니다. 이는 병렬로, 각막 표면에 접하는 바늘을 배향함으로써 방지 될 수있다가능한 홍채. 이것은 또한 주사 부위에서 비드의 손실을 최소화 할 것이다. 참고 : 안압 상승에 중요한 홍채 각막 각도, 주위에 고른 분포를 보장하기 위해 빠른 속도로 구슬을 주입한다. 또한, 점포 비즈, 자성 바늘과 링 별도로 구슬 주사기 및 주입에로드하도록 어렵게 클러스터를 형성하지 않도록, 그리고 바늘 자화가되지 않는다. 비즈 섬유주에서 수성 배수를 방해 홍채 각막 각도에 정착되도록 1 분 후 주입을위한 장소에 바늘을 둡니다. 약간 각도 비드 후 바늘 처음 IOP 일시적인 증가를 최소화하기 위해, 수용액 중 일부를 누설하도록 정착했다. 수술의 끝에서 제 인산 완충 생리 식염수 (PBS)로 바늘을 통해 세척 한 후, 증류수이어서 70 % 에탄올, 분리 과정에서 바늘의 계속적인 사용을 보장한다. 대안 적으로, 하나는 사용할 수올바른 게이지 주사기 조합을 사용할 수있는 경우 일회용 바늘. 선택적 : 바늘의 사용을 연장 beveller을 날카롭게하여 될 수있다. 이 단계에서는 필요한 경우에, 자석을 제거하고 불완전한 범위의 영역으로 구슬을 그릴을 사용합니다. 비즈 홍채 각막 각도에 잘 정착하기 위해 추가로 10 분 후 주입 눈 주위 장소에 자석을 남겨주세요. 0.25 ㎎ / kg atipemezole 염산염을 사용하여 역방향 마취. 감염을 방지하기 위해 국소 예를 들어, 겐타 마이신 또는 terramycin에 대한 클로람페니콜, 또는 다른 항생제 연고를, 관리 및 통증에 대한 0.5 % proparacaine 염산염. 그들은 운동을 되 찾을 때까지, 열 매트에 복구하는 동물을 남겨 복구가 완료 될 때까지 다음과 같은 보조 식품이나 적신 일반 다이어트로 추가 영양, 따뜻한 상자와 공급에 전송합니다. 전신 또는 로컬 통증은 수술 후 통증이 24 시간의 흔적을 표시하는 동물에게 주어져야한다. 살전 경우전자 증상이 치료에도 불구하고 지속, 동물을 인도적으로 도태되어야한다. 작동이되지 않는 대조군으로 반대쪽 눈을 사용하십시오. 비드 투여 후 2-3 일마다 안압 측정을 수행하고, 2-3 일마다 그 후 쥐의 눈 (9)에 사용하기 위해 교정 리바운드 안압계를 사용하여. 1)는 IOP는 5mmHg 의해 반대측 제어 압력 이상 상승하는 경우, 2) 60 mmHg로를 초과하지 않는다 : 연구에서 눈을 포함하는 기준이 될 수있다. (통상 1 주일 후 분사함으로써) 기준선 압력 복귀가 연구에 포함되지 않아야 감아, 그러나 원하는 경우 높은 IOP를 개발하는 데 실패 눈에 다시 주입 비드 할 수있다. 실험의 끝에 CO 2 질식에 의해 동물을 안락사. 눈 및 시신경을 해부하고, 밤새 더 조직학 분석을 위해 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 고정한다. 2. TUNEL S를 사용하여 망막 신경 세포 손상 평가함유 성 제조업체의 지침에 따라, 단말기 데 옥시 뉴 클레오 타이 딜 트랜스퍼 중재 dUTP를 닉 라벨 (TUNEL) 분석 retinasuse 전체 마운트에서 사멸 세포를 정량화합니다. 인산 0.3 % 트리톤 X-100에 3 × 5 분 완충 식염수 (T-PBS)를 세척, 아이 컵에서 망막을 해부하다. 2 시간 동안 3 % T-PBS에서 조직을 Permeabilize 하시려면. 37 ° C에서 1 시간 동안 TUNEL 반응 용액에서 배양하기 전에, 10 분 동안 평형 완충액 망막 전 평형. 0.3 % T-PBS 5 μM DAPI를 포함하는 린스, 0.3 % T-PBS에서 3 × 5 분 동안 조직을 씻고 설치 미디어에서 평면 마운트합니다. TUNEL 긍정적 인 핵는 20 배 배율에서 신경절 세포 계층을 통해 10 μm의 Z – 스택을 취할 공 초점 현미경을 사용하여 정량화합니다. 전체 MOUN 당 12 이미지의 총을주고, 망막의 먼 주변에 중반 주변에, 시신경에 가까운 장소에서, 4 꽃잎에 각각 3 이미지를 가지고,t는 약 7000 세포를 샘플링. 형태 학적 기준은 신경 세포에서 비 신경 세포 (내피 세포와 교세포) 세포를 차별. 치료 그룹에 만 DAPI 채널, 마스크 조사관을 사용하여 이미지를 선택 영역. 3. 톨루이딘 블루 염색을 사용하여 시신경 손상 평가 밤새 4 ° C에서 Karnovsky의 솔루션에 시신경을 수정합니다. 1 % (w / v)의 산화 오스뮴에서 2 시간 동안 처리하고, 표본을 100 % 에탄올로 탈수. 30 분 동안 프로필렌 옥사이드의 시신경을 품어, 프로필렌 산화물의 50:50 혼합 배치 : 아랄 다이 하룻밤. 하룻밤 60 ℃에서 배양 한 다음 100 % 아랄 다이에이 솔루션을 변경할 수 있습니다. 컷 semithin 섹션 (0.75 mm 두께)과 광학 현미경으로 검사하기 전에 50 % 에탄올 1 % 톨루이딘 블루 / 붕사 (TB)와 얼룩. 4. 통계 분석 통계 아나을 수행적절한 통계 소프트웨어 패키지를 사용 lyses. 뉴만 – Keul의 사후 시험과 양방향 ANOVA는 IOP는 경시 변화에 대한 통계적 유의성을 계산하는데 사용될 수있다. 0.05 미만의 P 값은 유의 한 것으로 간주 될 수있다.