磁気マイクロスフェアの眼注射によって誘発実験緑内障

倫理声明 ：すべての動物実験は、施設内動物管理使用委員会（IACUC）に従って行われており、英国内務省のガイドラインと一致して承認された（ http://goo.gl/FLkirW 、最後の6月番目の 10にアクセス、2014）と、眼科及び視覚研究（中動物の使用に関するARVO声明http://goo.gl/4LFOjDは 、最後の10 番目の 6月、2014年）をアクセスした。 1.高眼圧症の誘導 Samsel らの方法に基づいて、ブラウンノルウェーラットの前房内に常磁性ミクロスフェアの一側性注射を介して眼内圧（IOP）を上昇させることにより実験的緑内障を誘発する。これらは、検証される必要があるが、3他の着色されたラットは、適切であり得るユーザーによる最初。 ハウス250〜300 gの女性食料と水を自由に摂取して、IOP 7日内変動を最小限に抑えるために一定の低照度環境でのEX-ブリーダーブラウンノルウェーラット（40〜60ルクス）。 ラットの眼9で使用するために較正されたリバウンド眼圧計を使用して、前麻酔ビード注射覚醒動物8ベースラインIOP測定を行う。 IOPは、5つの測定値の平均値とする。 腹腔内に納入37.5 mg / kgをケタミン、および0.25 mg / kgをメデトミジン塩酸塩としたラットを麻酔し。動物の後足反射神経をテストすることによって麻酔の深さを確認し、ヨウ素アプリケーション（ステップ1.5を参照）、およびビーズ注入をポビドン前に（ステップ1.8を参照）。鎮痛のために0.5％のプロパラカイン塩酸塩を管理します。 注：いずれかの段階で瞳孔を拡張しないでください。これは、ビーズが隅角に優れ落ち着く、とレンズへの結合を防ぐのに役立ちます。非手術反対側の眼に角膜の乾燥を防ぐために、眼軟膏を適用します。 W注射前に水10 5分で5％ポビドンヨードと作動目を灰。 5分後、滅菌ガーゼを使用してオフにポビドンヨードを吸い上げ、0.9％滅菌生理食塩水で目を洗う。滅菌生理食塩水の定期的なアプリケーションとの麻酔中湿った目を離さない。 目の周りのトロイダル磁石を配置します。 33 Gベベル針を使用して、前房内にハンクス平衡塩溶液（HBSS）で8μmの磁気マイクロスフェアを滅菌ガンマ線照射の30 mg / mlのを含む溶液25μlを注入。 ビーズを調製するために、最終の30 mg / mlの溶液を作成する前に、1mlのHBSSで5分間、10,000×gで3回遠心分離し、再懸濁することにより洗浄する。全体の無菌状態を維持してください。 注射のために、アイリス外傷のリスクを最小限に抑えるために、アイリスに針を挿入しないように注意してください。これはに平行として、角膜表面に対して接線針を配向することによって防止することができますできるだけアイリス。これはまた、注射部位からのビーズの損失を最小限に抑えるのに役立つ。 注：IOPを上げるために重要である隅角、周りにも分布を確実にするために急速にビーズを注入。また、ストアビーズ、針と磁性環別々ビーズは、それらが困難シリンジにロードし、注入すること、クラスターを形成せず、針が磁化されないように。 ビーズは小柱網から水の排水を妨げるために隅角に落ち着くことを保証するために1分後に注射のために所定の位置に針を残します。わずかに角度がビーズ後の針は、最初はIOPの一過性の増加を最小限に抑えるために、水の一部漏出を可能にするために定住している。手術の最後に最初のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で針を介してフラッシュし、その後、蒸留水、続いて70％エタノールは、別個の手順において、ニードルの継続的な使用を確保する。あるいは、使用することができます使い捨ての針正しいゲージと注射器の組み合わせが利用可能な場合。オプション：針はそれらの使用を延長するbevellerを使用して先鋭化することができる。 必要であれば、この段階では、マグネットを削除し、不完全な被覆の領域にビーズを描画するためにそれを使用。 ビーズが隅角にうまく解決することを確認するために、さらに10分後に、注射のために目の周りの所定の位置に磁石のままにしておきます。 0.25 mg / kgをatipemezole塩酸塩を用いて逆麻酔。 感染を予防するために局所的に、例えばゲンタマイシン又はテラマイシンために、クロラムフェニコール、または他の抗生物質軟膏を管理、および鎮痛のための0.5％塩酸プロパラカイン。回復が完了するまで、そのような栄養補助食品または湿らせた通常の食事として、追加の栄養と暖かいボックスと電源に転送し、その後、彼らは動きを取り戻すまで、ヒートマットの上に回復する動物のままにしておきます。全身または局所鎮痛は、手術後の痛みの24時間の兆候を示す動物に与えられるべきである。 THESの場合Eの症状は治療にもかかわらず持続する、動物が人道的に殺処分されるべきである。 無操作コントロールとして反対側の目を使用してください。 ビーズ投与後2〜3日ごとに、その後、ラットの目9で使用するために校正さリバウンド眼圧計を使用して2〜3日ごとにIOP測定を行う。 1）IOPが5 mmHgのことで反対側の制御圧力以上に上昇した場合、および2）60 mmHgのを超えていない：研究で目を含むための基準とすることができる。 （通常は1週間後に注射による）ベースラインに圧力戻り、研究に含めるべきではない目は、しかし、それは、必要に応じて、高IOPを開発するために失敗するの目に再注入するビーズが可能である。 実験の終了時にCO 2窒息により動物を安楽死させる。 眼および視神経を分析し、さらなる組織学的分析のために一晩、4％パラホルムアルデヒド（PFA）で固定する。 2. TUNEL Sを使用して、網膜神経細胞のダメージを評価するtaining 製造業者の説明書に従って、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介dUTPニック標識（TUNEL）アッセイretinasuseホールマウント内のアポトーシス細胞を定量化する。 リン酸緩衝生理食塩水（T-PBS）中の0.3％トリトンX-100で3×5分間洗浄し、アイカップから網膜を解剖。 2時間、3％のT-PBSで組織を透過性。 37℃で1時間TUNEL反応液中でのインキュベーションの前に、10分間の平衡化バッファーで網膜を予め平衡化。 5μMDAPIを含む0.3％T-PBSですすぎ、0.3％T-PBSで3×5分間組織を洗浄し、実装メディアにフラットマウント。 TUNEL陽性の核が20倍の倍率で神経節細胞層を通して10ミクロンのzスタックを取る共焦点顕微鏡を使用して定量化する。全体mounあたり12画像の合計を与え、網膜の遠い周辺部に半ば周囲には、視神経に近い所で、4花びらのそれぞれに3画像を撮影し、tは、約7000の細胞をサンプリングする。形態学的基準は、神経細胞からの非ニューロン（内皮細胞およびグリア）細胞を区別し。 唯一のDAPIチャネルを使用して画像化する領域を選択して、処置群に捜査をマスクする。 3.トルイジンブルー染色を用いて視神経損傷の評価一晩4℃でカルノフスキーの溶液中で視神経を修正。 1％（w / v）の四酸化オスミウムで2時間の試料を処理し、その後、100％エタノールで脱水する。 30分間のプロピレンオキシドで視神経をインキュベートし、プロピレンオキシドの50:50混合物中に置く：アラルダイト一夜。 60℃で一晩インキュベートし、100％アラルダイトこの溶液を、変更する。 カット半薄切片（0.75ミリメートルの厚さ）し、光学顕微鏡による検査の前に50％エタノール中の1％トルイジンブルー/ホウ砂（TB）で染色する。 4.統計分析統計的ANAを実施適切な統計ソフトウェアパッケージを使用して溶解する。ニューマン-Keulのポストホック検定を二元配置ANOVAは、IOPが経時的に変化するための統計的有意性を計算するために使用され得る。 0.05未満のp値を有意とみなしてもよい。