实验诱发青光眼通过磁性微球注射眼

伦理学声明 ：所有的动物实验均按照该机构动物护理和使用委员会（IACUC）已经进行，并批准了与英国内政部的指导方针一致（ http://goo.gl/FLkirW ，上次访问10 日止 ，2014年）和ARVO声明动物的眼科和视觉研究（使用http://goo.gl/4LFOjD ，上次访问10 日 2014年6月，）。 1.高眼压感应通过提高经由单侧注射顺磁性微球的眼内压（IOP）到棕色挪威大鼠前房，基于Samsel 等人的方法中诱导实验性青光眼。3的其它着色大鼠可以是合适的，尽管这些将需要进行验证首先由用户设定。 楼250-300克重的雌前饲养员布朗Norway大鼠中的恒定的低光环境（40-60勒克斯），以在眼压7最小化昼夜的波动，以获得食物和水随意 。 就拿基线眼压测量清醒动物8前麻醉和注射珠，利用反弹眼压计校准大鼠的眼睛9使用。眼压取为5个读数的平均值。 麻醉大鼠37.5毫克/公斤氯胺酮，并发表腹腔0.25毫克/公斤盐酸美托咪定。通过测试动物的后足反射确定麻醉深度，聚维酮碘的应用程序（见步骤1.5），和珠注射之前（见步骤1.8）。管理0.5％盐酸丙美卡因镇痛。 注：在任何阶段不要扩张瞳孔。这将有助于珠粒沉降更好入虹膜角膜角，并防止结合到透镜。适用于眼软膏以防止非手术对侧眼的角膜干燥。 W¯¯灰手术眼用5％聚维酮碘在水注射前10 5分钟。 5分钟后，灯芯的聚维酮碘断用无菌纱布，并用0.9％无菌盐水的溶液洗眼睛。保持眼部麻醉用无菌生理盐水常规应用过程中湿润。 将眼睛周围的环形磁铁。 注入25μl的含30毫克/毫升的γ-照射消毒的Hank氏平衡盐溶液（HBSS）8微米的磁性微球进入前房，用33克斜口针的溶液中。 为了制备珠，通过再悬浮洗涤，然后离心3次以10,000×g离心5分钟，用1ml HBSS，使最后的30毫克/毫升溶液之前。保持整个无菌条件。 对于注射，要小心避免插入针虹膜，尽量减少虹膜损伤的风险。这可以通过定向针正切于角膜表面被防止，为平行于虹膜越好。这也将有助于减少从注射部位珠损失。 注：注入珠以极快的速度，以确保均匀围绕虹膜角膜角，这是为了提高眼压关键分布。此外，存储珠，针头和磁性环分开，使得所述珠不形成簇，使得它们难以加载到注射器中，并注入，以及针不会被磁化。 留针到位1分钟后注射，以确保珠融入了房角从小梁阻碍房水引流。稍后角珠针已初步解决，使水的一些泄漏，最大限度地减少瞬时增加IOP。在手术结束时通过冲洗将针与第一磷酸盐缓冲盐水（PBS），然后70％的乙醇，随后用蒸馏水，以确保继续使用在分开的程序针。可替代地，人们可以使用如果正确的计和注射器组合是可用的一次性针头。可选：针可以使用beveller延长它们的使用被激化。 在此阶段，如果需要，除去磁体，并用它来绘制珠粒成不完全覆盖的区域。 离开磁铁在眼睛周围的地方为另外的10分钟后喷射，确保珠粒沉降顺利进入虹膜角膜角。 使用0.25毫克/公斤盐酸反atipemezole麻醉。 辖氯霉素，或其他抗生素软膏，例如庆大霉素或土霉素局部，以防止感染，和0.5％的盐酸丙美卡因镇痛。离开动物恢复上热垫，直到他们恢复运动，然后转移到一个暖箱和供应额外的营养，比如辅食或蘸正常饮食，直到恢复完成。全身或局部镇痛应给动物手术后疼痛显示24小时的迹象。如果THESË症状持续，尽管治疗，动物应得到人道扑杀。 用对侧眼作为非工作的控制。 就拿IOP测量每2-3天珠给药后，每2-3天使用后的反弹眼压计校准大鼠的眼睛9使用。 的标准，包括眼睛的研究中可以是：如果1）眼压升高对侧控制压力之上5毫米汞柱，和2）不超过60毫米汞柱。 眼睛其中压力恢复到基线（通常1周后喷射）不应该被包括在研究中，但也可以在眼睛失败，如果需要开发高眼压重新注入珠。 安乐死的动物用CO 2窒息在实验结束。 解剖眼睛和视觉神经，并在4％多聚甲醛（PFA）过夜进一步的组织学分析解决。 2.评估视网膜神经元损伤使用TUNEL S泰宁为了量化凋亡细胞在整装retinasuse终端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口标记（TUNEL）测定中，根据制造商的说明。 解剖从眼罩视网膜，冲洗3×5分钟，在0.3％的Triton X-100的磷酸盐缓冲盐水（T-PBS）中。 透在3％的T-PBS中的组织2小时。 在37℃预平衡的平衡缓冲液视网膜10分钟，温育在TUNEL反应溶液之前1小时。 洗净组织在0.3％T-PBS 3×5分钟，冲洗0.3％T-PBS含5μMDAPI，并在安装媒体平板安装。 量化TUNEL阳性细胞核使用共聚焦显微镜拍到10微米的z栈通过神经节细胞层，在20X放大倍数。取3个图像上每个4花瓣，在站点靠近视神经，在中间周，并在视网膜的远边缘，总计每整MOUN 12的图像T，采样约7000细胞。形态学标准区分非神经元（内皮细胞和神经胶质细胞），从神经元细胞。 仅使用DAPI通道，并且掩模研究者对治疗组进行摄像选择区域。 3.评估视神经损害使用​​甲苯胺蓝染色修复视神经一夜之间在4℃Karnovsky的解决方案。 在1％（重量/体积）的四氧化锇处理试样2小时，然后脱水在100％乙醇。 孵育视神经中的氧化丙烯30分钟，并将其放置在环氧丙烷的50:50混合物：ARALDITE过夜。 过夜，在60℃下改变该溶液至100％ARALDITE，接着培养。 切半薄切片（0.75毫米厚），并染色，用1％甲苯胺蓝/硼​​砂（TB）的在50％乙醇考试之前通过光学显微镜。 4.统计分析进行统计语录裂解用适当的统计软件包。双向ANOVA和纽曼-Keul的事后检验可以用于计算统计学显着性为眼压随时间而改变。 小于0.05的p值可以被认为是显著。