Mesenteric лимфатический проток канюлированного крысиной модели: Приложение к оценке кишечных лимфатической транспорта лекарства

Лимфатические течет из тонкого кишечника с помощью однонаправленного процесса, происходящего в отдельных млечными, которые содержатся в каждом маленьком кишечных ворсинок ^1. Млечными относительно проницаемой для жидкости, макромолекул, клеток и образование лимфы, таким образом, начинается с момента вступления этих факторов в млечными. Начальное лимфатических в млечными затем течет из кишечника через сеть лимфатических микрососудов, сбора (афферентной) лимфатических сосудов, серия брыжеечных лимфатических узлов и в конечном счете после узловой (эфферентных) лимфатических сосудов. В узлах, лимфатических проходит через серию мозговых синусов, где обмен происходит с иммунными клетками-резидентами узла, а также материала, поступающих в узел из крови. Все лимфатических течет из тонкой кишки в конечном итоге сходится в эфферентных превосходит брыжеечных лимфатических протоков и впоследствии цистерны chyli. Цистерны chyli также собирает лимфодренажный хвостового периферических тканей, IntestИнал, печени и поясничного отделов и присоединяется к грудной лимфатический проток вместе с лимфой из средостения и черепных частях тела. Грудной лимфатический проток впадает лимфатическую непосредственно в венозную систему на стыке левой внутренней яремной и подключичной вен. Протокол, описанный здесь, который позволяет сбора лимфы непосредственно из верхней брыжеечной лимфатический проток, таким образом, облегчает анализ различных факторов, проходящих прямо из кишечника в системной (общей) циркуляции через лимфатическую систему кишечника.

Основные физиологические функции, возложенные на желудочно-кишечном лимфатической системы для поддержания баланса жидкости, чтобы облегчить липидов и поглощение липофильный молекул, и, чтобы включить соответствующие иммунные реакции ^1. Опухолевые клетки и вирусы распространяются с помощью кишечной лимфатической системы ^2-4 и ключевые изменения происходят в лимфатических в ряде воспалительных и метаболических патологий ^5-7. Можетnulation брыжеечных лимфатический проток, чтобы собрать лимфы в брыжейки позволяет анализ объемного потока жидкости через кишечную лимфатические сосуды, а также количественное определение уровня концентрации и транспортной различных клеток и молекул. Изменения в концентрации или транзита этих факторов в ответ на различные вызовы (например, диеты, антигены, лекарственные средства) и в моделях болезни (например, колит, ВИЧ, диабет), также может быть оценено. Несмотря на то, что невозможно подробно описать каждый лимфы компонент, который может быть проанализированы и сравнены здесь, брыжеечных лимфатических упрощенно состоит из водного, липидов и клеточных фаз. Компоненты интерес в водной фазе, включают пептиды и белки, такие как антигены или tolerogens ^8, иммунных мессенджеров, таких как цитокинов и медиаторов тучных клеток ⁹ и метаболических медиаторов, таких как инкретинов ^10. Клеточный часть пост-узловой брыжеечных лимфатических состоит почти полностью (более 99%) lymphocytES ^11. Различные иммунные клетки (дендритные клетки, тучные клетки, и т.д.) ввести предварительно узловые брыжейки лимфатические но остаются в пределах узла ^12. Если клетки в афферентной лимфы представляют интерес, можно собрать эти клетки с помощью удаления брыжеечных лимфатических узлов за несколько дней до катетеризации брыжеечной лимфатический проток ^12. Таким образом, афферентные и эфферентные лимфатические протоки непосредственно связаны и лимфатических клеток в афферентных лимфатических проходить непосредственно в мезентериального лимфатического протока. Транзита и фенотип различных иммунных клеток, проходящих через кишечные лимфатические сосуды может быть, таким образом исследованы. Возможно, наиболее распространенной причиной привел для сбора брыжеечных лимфатических до настоящего времени, однако, заключается в изучении кишечной обработки, абсорбцию и транспорт пищевых липидов и липофильных молекул ^10.

После приема, пищевые жиры перевариваются (например, из триглицерида с жирных кислот и моноглицерида, phospholipid с жирными кислотами и lysophospholipid и сложного эфира холестерина в жирной кислоты и холестерин, и т.д.) и диспергированные в просвете кишечника на мелкие мицеллы и везикулярных структур с помощью добавлением амфифильных из желчи (фосфолипиды, холестерин и соли желчных кислот) и действие ферменты поджелудочной железы ^10,13. Отсюда они всасываются в энтероцитов. Доля поглощенных компонентов повторно этерифицируют с образованием триглицеридов, фосфолипидов и эфиров холестерина в пределах поглощающих клеток (энтероцитов). Эти переэтерификацией липиды собраны из комбинации экзогенно внутрь липидных компонентов и эндогенных липидных компонентов из секретируемого желчи, слизистой оболочки липидных бассейнов или кишечной кровоснабжения ^13. Отсюда этерифицированные липиды либо храниться в энтероцитов или собраны в кишечных липопротеинов (хиломикроны, липопротеинов очень низкой плотности (VLDL)) вместе с различными апопротеинов и других липофильных молекул ( <eм>, например, витамины) ^10,13. После выхода из энтероцитов, липопротеины специально транспортируется из кишечника в системный кровоток через лимфатическую систему брыжеечной как кишечные млечными более проницаемыми для их ввода кишечной чем кровеносных капилляров. Доля поглощенных липидных компонентов также транспортируется из кишечника в системный кровоток через кровеносные капилляры и воротной вены, как отдельная система, не липопротеина связанных молекул ^14. В целом, однако, воротной вены транспортного маршрута только играть важную роль в поглощении коротких и средней длины цепи липидов.

Сбор брыжеечных лимфатических таким образом, позволяет производить оценку транспортировки липопротеинов и связанных с ними компонентов (липидов, липофильных молекул, апо-белков) из кишечника. В липопротеины могут быть количественно и характеризуется тем преимуществом, что брыжеечные лимфатические липопротеины, в общем, в nascenт состояние, так как они не были широко изменен системных ферментов, таких как липазы липопротеинов ^15. Несмотря на то, брыжеечных лимфатических модель канюлируют крыса, возможно, исторически наиболее широко описаны для анализа липидов / липопротеинов транспорта в кишечнике, площадь расширяется интерес представляет роль лимфатической системы в транспорте липофильных лекарственных средств, пролекарства и других ксенобиотиков ^13,16 что акцент в модели, описанной здесь. Липофильных лекарственных средств (как правило, те, с журнала P> 5 и растворимости в долгосрочной триглицерида> 50 мг / г, хотя исключения являются очевидными) ^17,18 пролекарства ¹⁹ и другие ксенобиотики ^13,16 могут получить доступ к кишечной лимфатической системы или пассивно или активно интегрируется в кишечная липопротеинов транспортных путей ^19.

Таким образом, крысы брыжеечной лимфатических техники катетеризации имеет множество применений. Bollman и др. Впервые описал TechniqUE в иглу брыжеечных лимфатический проток у крыс в 1948 году ^20. Так были описаны то количество вариаций на модели. Например, коллекция может произойти, когда крыса анестезии с различными анестетиками ^21,22, или в сознательном состоянии, пока сдерживается ¹⁵ или свободно перемещаться ^23,24. Крысы могут быть введены различные регидратации растворы и другие вещества, такие как липиды и лекарственных форм с различными скоростями в желудок, кишечник или парентерально (обычно 0 – 5 мл / ч) ^25. В некоторых исследованиях грудной лимфатический проток, а не брыжеечных лимфатических канал канюли, чтобы оценить транспорт из кишечника через лимфатические сосуды, хотя это может переоценить транзит из тонкой кишки, в зависимости от коэффициента интерес, так как грудной лимфатический проток также получает лимфу от друга Регионы ^22,26. Лимфатические модели катетеризации также были описаны в ряде других видов, включая мышей ^15,27, мини-пиGS ^12, овец ^28,29, свиньи ³⁰ и собаки ^31. Тем не менее, модель крысы является наиболее широко и последовательно привел. Подробные протоколы для катетеризации брыжеечной лимфатический проток, с последующим сбором лимфы в сознательном ²⁵ или наркоза ²² крыс и мышей ^15,27 были опубликованы ранее, и заинтересованный читатель относится к этим протоколам. Этот протокол является первым, чтобы продемонстрировать технику в визуализируется формате.

Лимфатических канюлируют крысах имеет преимущества перед более крупных моделей животных с точки зрения расходов, легкость операции и этических соображений. По сравнению с мышиной модели, брыжеечных лимфатических катетеризации операции также легче у крыс, хотя модель мыши дает более подробные исследования в трансгенных животных ^27. Тем не менее, есть некоторые ограничения модели крыс, особенно те, которые связаны с различиями в физиологии, что предел extrapolatионов к другим доклинических и клинических ситуациях. Например, в потоке крыс желчного постоянна и не зависит от приема пищи, тогда как в более высокой пищи или липидов видов стимулировать выделение желчи ^32. Это создает проблемы для получения репрезентативных до и после приема пищи среды у крыс, которые отражают то, что видел в более крупных видов и человека. Для исследований доставки лекарств, более крупные виды также могут быть предпочтительными при оценке лимфатической транспорта после введения реалистичного человека лекарственных форм ^25. В недавнем исследовании, липидов ставки переноса в брыжеечных лимфатических оказались сопоставимы у разных видов (мыши, крысы, собаки) после введения эквивалентной массы и типа липидов, который обеспечивает некоторую уверенность в экстраполяции транспорта липидов данных разных видов ^27. Тем не менее, транспортировка модели липофильный лекарственный препарат, Галофантрин, попавшая в порядке размера животного (например, собака> крыса> мыши). Коэффициент масштабирования может быть, таким образом требуется эксtrapolate лимфатические препарат транспортные данные крысы с другими видами.

Ограничение моделей лимфатических катетеризации, в общем, является то, что пассивное лимфатических коллекции непосредственно из лимфатического протока может изменить лимфы и транспортировки, так как лимфатические сосуды работать против градиента давления, который изменен после того, как сосуд через канюлю ^33. Лимфатических катетеризация модель также может быть трудно установить в лабораториях, которые не знакомы с техникой. Альтернативные модели, таким образом, были описаны. Например, транзит факторов через лимфатическую систему кишечника, таких как липопротеины и липофильных молекул, был изучен с помощью косвенного сбора крови. Одной из таких моделей включает сравнение концентрации в крови липидов и / или лекарственных средств после перорального, в присутствии и в отсутствие ингибиторов (например, колхицин, Pluronic L81, циклогексимид) кишечной производства липопротеинов, которые блокируют лимфатической транспорта ^34. Преимуществомоделей, которые количественно лимфатической транспорта косвенно через сбора образцов крови является то, что она позволяет некоторую оценку лимфатической транспорта как у человека, инвазивная хирургия не требуется ^35. Тем не менее, ингибиторы транспорта лимфатической не являются специфическими и факторы, которые транспортируются через лимфатические сосуды разбавляют и модифицированы в системный кровоток, что затрудняет таких оценок. В пробирке альтернативы также были описаны. Например, Caco-2 клеток или изолированных энтероцитов культуры были использованы для изучения более подробно кишечного секрецию молекул, которые входят в лимфатических ^36-38. Продвинутая модель в пробирке, что является более представительным кишечного микроокружения человека также недавно был описан ^39. В этой модели лимфатической эндотелиальной слой клеток совместно культивируют с Caco-2 клеток, которые обеспечивает более детальный анализ переноса веществ из кишечника в лимфатическую систему. Тем не менее, в ВИТРО клеточные системы не хватает перетока и передать то есть взаимосвязь с просвета кишечника и основного крови и лимфатической кровоснабжения. В альтернативном подходе, Кассис и др. Установлено, двухканальный (высокоскоростной светлого поля видео и флуоресценции) в системе формирования месте, что позволяет количественные сравнения между судном сжатия, лимфы и люминесцентные концентрации липидов в мезентериальных лимфатических сосудов ^33. Преимущество этой модели над вышеупомянутый в пробирке системы является то, что он обеспечивает точное отслеживание прохождения иммунных клеток через лимфатические сосуды. Абсолютные измерения массового липидов (или препарата) транспортом, однако, еще не создана с использованием методов визуализации. В пробирке и в кремнии подходы к специально предсказать степень липофильного транспорта наркотиков с помощью кишечной лимфатической системы также были опубликованы ^40-42. Например, экс виво сродство с несколькимиompounds для плазменных хиломикронов коррелирует достаточно хорошо с их лимфатической транспорта в естественных условиях ^41. Впоследствии та же группа создана в силикомарганца модели для прогнозирования наркотиков сродство к хиломикронов, основанных на нескольких физико-химических свойств ^40. Холм и др. Также установили относительно сложным в силикомарганца модели, чтобы предсказать, напрямую лимфатической транспорта липофильных соединений на основе молекулярных дескрипторов ^42. Эти модели могут обеспечить полезный подход для прогнозирования степени лимфатической транспорта неизвестных препаратов. Валидация моделей с широким диапазоном наркотиков и между различными лабораториями, однако, требуется, чтобы подтвердить их точность и воспроизводимость.

Катетеризация брыжеечной лимфатический проток, таким образом, остается единственное средство непосредственно ознакомиться с содержимым лимфодренажный тонкую кишку, и транзитной ставке в сложный комплекс факторов (клеток, белков,пептиды, липиды, лекарственные препараты) в лимфе в в естественных условиях ситуации. В этом мы описываем протокол для катетеризации брыжеечных лимфатических протоков и сонной артерии, что позволяет сбора брыжеечных лимфатических и системной крови из анестезированных крыс. Типичные данные показывают, как модель может быть использован для изучения липидов и транспорта лекарства из кишечника через лимфатическую систему брыжеечной. Это последовало обсуждение трудностей, которые могут возникнуть при создании модели и руководство по устранению неисправностей. После создания модели является мощным инструментом исследования кишечника лимфатической транспорта.