We describe methods for longitudinal monitoring of the efficacy of therapeutics for the treatment of colonic pathologies in mice using a rigid endoscope. This protocol can be readily used for the characterization of the therapeutic response of an individual tumor in live mice and also for monitoring potential disease relapse.
Animal models of inflammatory bowel disease (IBD) and colorectal cancer (CRC) have provided significant insight into the cell intrinsic and extrinsic mechanisms that contribute to the onset and progression of intestinal diseases. The identification of new molecules that promote these pathologies has led to a flurry of activity focused on the development of potential new therapies to inhibit their function. As a result, various pre-clinical mouse models with an intact immune system and stromal microenvironment are now heavily used. Here we describe three experimental protocols to test the efficacy of new therapeutics in pre-clinical models of (1) acute mucosal damage, (2) chronic colitis and/or colitis-associated colon cancer, and (3) sporadic colorectal cancer. We also outline procedures for serial endoscopic examination that can be used to document the therapeutic response of an individual tumor and to monitor the health of individual mice. These protocols provide complementary experimental platforms to test the effectiveness of therapeutic compounds shown to be well tolerated by mice.
कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी) द्रोह दुनिया भर में एक के 4 वें सबसे आम कारण है। इस रोग का पारिवारिक आधार के बारे में हमारी समझ में महत्वपूर्ण प्रगति के बावजूद, आनुवंशिक गड़बड़ी केवल सीआरसी मामलों दो की ~ 20% करने के लिए योगदान देता है। शेष जीर्ण सूजन सहित अनेक बाह्य और पर्यावरणीय कारकों को जिम्मेदार ठहराया जाता है। इंसानों में, जीर्ण सूजन और पेट के कैंसर के बीच की कड़ी अल्सरेटिव कोलाइटिस कोलाइटिस जुड़े पेट के कैंसर (सीएसी) के विकास का एक बड़ा खतरा है, जो (यू) के रोगियों में स्पष्ट है, सूजन की बीमारी तीन की अवधि, विस्तार और गंभीरता पर निर्भर करता है -5। तदनुसार, उपन्यास उपचारों प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और भड़काऊ ट्यूमर microenvironment 6-8 से विकास को बढ़ावा देने वाले कारकों में से जुड़े उत्पादन को नियंत्रित करने के लिए विकास में हैं। की चिकित्सीय प्रभावकारिता को चिह्नित करने के लिए उपयुक्त पूर्व नैदानिक पशु मॉडल के लिए वहाँ एक बढ़ती आवश्यकता हैविकास और रोग की प्रगति के खिलाफ इन दवाओं।
माउस मॉडल स्पष्ट भड़काऊ microenvironment भी प्रकट सूजन 9,10 के अभाव में, सीआरसी प्रगति में योगदान देता है कि प्रदर्शन किया है। इन मॉडलों को उपकला चोट और तीव्र और जीर्ण सूजन आंत्र रोग (IBD) 11,12 मॉडल करने के लिए चूहों के पीने के पानी में प्रदान की पोलीसेकेराइड dextran सल्फेट सोडियम (डीएसएस) का उपयोग करते हैं, शामिल हैं। इस के बारे में mucosal नुकसान और कोलाइटिस लाती व्यवस्था है जिसके द्वारा पूरी तरह से समझ नहीं है, हालांकि कुछ अध्ययनों से इस के बारे कोशिकाओं के भीतर सेलुलर रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस और ribonuclease गतिविधियों को रोकता है, या colonic झिल्ली क्षति उपकला के लिए अग्रणी के साथ फ्यूज कि नैनो लिपिड परिसरों के गठन को बढ़ावा सुझाव है कि 13,14। मानक डीएसएस मॉडल में संशोधन भी colonic उपकला कोशिकाओं ऊतक homeostasis और नियमित बनाए रखने के द्वारा जो तंत्र में महत्वपूर्ण जानकारी उपलब्ध कराई हैदेर mucosal प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 15।
Azoxymethane (AOM) की intraperitoneal प्रशासन अकेला, या इस के बारे में संयोजन के साथ, उपकला mucosa और भड़काऊ और स्ट्रोमल microenvironment 16,17 में दैहिक म्यूटेशन के बीच परस्पर क्रिया की जांच के लिए एक मॉडल प्रदान करता है। AOM सीधे डीएनए उत्परिवर्तन में परिणाम नहीं करता कि कैसरजन 1,2-dimethylhydrazine (DMH) की एक metabolite है। इसके बजाय, AOM एमएएम ग्लुकुरोनिक एसिड के साथ संयुग्मित और फिर पित्त स्राव 18 के माध्यम से आंत के लिए ले जाया जाता है, जहां जिगर में साइटोक्रोम isoform CYP2E1 द्वारा (mam) methylazoxymethanol को hydrolyzed है। यह जीवाणु β-glucuronidase डीएनए alkylation में जिसके परिणामस्वरूप एमएएम की गिरावट और उपकला कोशिकाओं 19 में म्यूटेशन के संचय के लिए योगदान देता है कि माना जाता है। अधिकांश AOM प्रेरित colonic ट्यूमर proteasomal degradati के लिए प्रतिरोधी प्रोटीन प्रतिपादन, जीन एन्कोडिंग β-catenin में missense म्यूटेशन बंदरगाहविहित Wnt-संकेतन मार्ग 20 की न्यायपालिका सक्रियण में जो परिणाम पर। AOM की गतिविधि को इस के बारे द्वारा हासिल mucosal क्षति के साथ संयुक्त है, प्रतिक्रिया चिकित्सा आगामी घाव mutagenized उपकला के विकास और विस्तार के लिए अनुकूल है कि एक microenvironment बनाता है। इस मॉडल के विभिन्नता में, अकेले कई सप्ताह की अवधि में AOM का दोहराव प्रशासन इस के बारे प्रेरित कोलाइटिस 10,17 के अभाव में छिटपुट कोलोरेक्टल कैंसर मॉडल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इन दो मानार्थ मॉडल एक समर्थक भड़काऊ ट्यूमर microenvironment 10 के साथ जुड़े रहे हैं, जो दोनों के क्रमश सीएसी और छिटपुट सीआरसी अध्ययन करने के लिए प्रयोगात्मक सेटिंग, प्रदान करते हैं।
चूहों में सीरियल एंडोस्कोपी के उपयोग बेकर और उनके सहयोगियों ने 21 ने बीड़ा उठाया है, और कोलाइटिस और ट्यूमर प्रगति के अनुदैर्ध्य निगरानी में सक्षम बनाता रहा था। यहाँ हम इस के बारे प्रेरित mucosal नुकसान और / या AOM की मध्यस्थता टीयू के आधार पर तीन पूर्व नैदानिक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैंmor के प्रेरण reproducibly विशिष्ट colonic विकृतियों को प्रेरित करने के लिए। पहले प्रोटोकॉल आईबीडी के साथ जुड़े histopathological सुविधाओं के कई बटोर डीएसएस प्रशासन के जवाब में तीव्र mucosal क्षति उत्प्रेरण का वर्णन है। दूसरा प्रोटोकॉल सामान्यतः आईबीडी रोगियों में मनाया सूजन के फ्लेयर्स नकल करने के लिए इस के बारे में प्रशासन की लगातार तीन चक्र पर आधारित है, और AOM प्रेरित परिवर्तन के साथ संयोजन के रूप में किया जा सकता है। अंतिम प्रोटोकॉल AOM प्रेरित छिटपुट उपकला म्यूटेशन पर आधारित है। इन प्रोटोकॉल में से प्रत्येक के लिए, हम हम नई दवाओं की प्रभावकारिता की निगरानी के लिए विकसित किया है कि रोगनिरोधी और चिकित्सीय हस्तक्षेप के तरीकों में शामिल करने के लिए प्रासंगिक मानक प्रक्रियाओं पर विस्तार।
चूहों में colonic रोग विकृति विज्ञान के विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रेरण की रूपरेखा तरीकों का वर्णन किया गया हैं कि तीन प्रोटोकॉल। दिनचर्या इंडोस्कोपिक निगरानी और यहाँ उल्लिखित हस्तक्षेप रणनीतियों के साथ संयुक्त, इन प्रोटोकॉल चिकित्सा विज्ञान की प्रभावकारिता में शक्तिशाली पूर्व नैदानिक अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा। हमारी प्रयोगशालाओं नियमित उपन्यास चिकित्सा विज्ञान 10,23,24 की सफलता की निगरानी करने के लिए इन प्रोटोकॉल के सभी का उपयोग करें।
एक पूर्व नैदानिक पशु मॉडल चुनने नई चिकित्सा परीक्षण करने के लिए जब विचारों की एक संख्या हैं। ये मानव रोग के लिए मॉडल की प्रासंगिकता, और चिकित्सीय लक्ष्य की प्रस्तावित कार्रवाई के लिए ट्यूमर microenvironment का योगदान शामिल है। यहाँ हम स्थापित आंत्र रोग मॉडल में चिकित्सकीय हस्तक्षेप के लिए तीन प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इन मॉडलों प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य होते हैं और रोग को उत्पन्न करने के लिए अभिकर्मकों के वितरण का प्रबंधन करने के लिए आसान है। महत्वपूर्ण बात है, मॉडल अत्यधिक प्रासंगिक हैंकई पहलुओं और कोलाइटिस शुरुआत की, और ट्यूमर दीक्षा और प्रगति के चरणों के लिए। शोधकर्ताओं ने काफी 25 अलग-अलग हो सकता है इस के बारे में और / या AOM द्वारा प्रेरित रोग के लिए खतरा के रूप में, ध्यान में प्रयोगों को डिजाइन का इस्तेमाल किया जब माउस उपभेदों की आनुवंशिक पृष्ठभूमि लेना चाहिए। इसके अलावा, विभिन्न सूक्ष्म समुदायों बैक्टीरिया द्वारा metabolized है जो AOM, के संदर्भ में विभिन्न चयापचय क्षमता हो सकती है। हम एक ही प्रयोग में (वाणिज्यिक विक्रेताओं सहित) विभिन्न जानवरों की सुविधाओं में पैदा हुए थे कि चूहों के विभिन्न साथियों उपयोग करने के खिलाफ चेतावनी देते हैं। इसी प्रकार, विभिन्न सुविधाओं से इस्तेमाल चूहों में अलग microflora अलग मेजबान प्रतिक्रियाओं उपकला बाधा क्षति 11 प्रेरित DSS को प्रकाश में लाना हो सकता है। इसके अलावा, (उदाहरण के शाही सेना शुद्धि के लिए) ऊतक का उचित विश्लेषण भी बाद में आणविक विश्लेषण 26,27 पर असर होगा रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस को बाधित करने के लिए डीएसएस की क्षमता, के बाद से विचार किया जाना चाहिए।
<p claएस एस = "jove_content"> माउस एंडोस्कोपी बार बार एक व्यक्ति माउस में रोग शुरुआत और प्रगति की निगरानी के लिए एक अत्याधुनिक तकनीक है। वीडियो रिकॉर्ड और अभी भी छवियों निकालने की क्षमता कई रोग मापदंडों और ट्यूमर के लिए आसान निगरानी परमिट। पशु कल्याण में सुधार के अलावा, इंडोस्कोपिक निगरानी भी परंपरागत रूप से रोग परिणाम ट्रैक करने के लिए अलग-अलग समय अंक में मारी गईं थे जो प्रयोगात्मक चूहों के कई साथियों, के लिए की जरूरत कम कर देता है। MEICS स्कोरिंग प्रणाली histopathological विश्लेषण के लिए एक विकल्प नहीं है, बल्कि एक वैकल्पिक लाइव चूहों में पशु स्वास्थ्य और mucosal क्षति की निगरानी करने के लिए साधन प्रदान करता है। माउस एंडोस्कोपी एक विशेष प्रयोगशाला तकनीक है, और सभी प्रक्रियाओं चूहों का उचित हेरफेर और हैंडलिंग सुनिश्चित करने के लिए, साथ ही रोग स्कोरिंग के लिए इस्तेमाल किया छवियों में लगातार गुणवत्ता प्रदान करने के लिए प्रशिक्षित कर्मियों द्वारा किया जाना चाहिए। योग्य व्यक्तिगत के हाथों में, हम एंडोस्कोपी tumo करने के लिए बहुत कम या कोई नुकसान लाती ने पाया है किइंट्रा-tumoral रक्तस्राव का कारण होता है कि रुपये। यह प्रारंभिक ट्यूमर बोझ निर्धारित करने के लिए एक तरीका प्रदान करता है, और एक चिकित्सकीय दवा के प्रशासन के पहले इसी तरह के ट्यूमर बोझ के साथ पशुओं के समूह साथियों के लिए हमें की अनुमति देता है के बाद से उल्लिखित चिकित्सकीय प्रोटोकॉल के लिए, हम, एंडोस्कोपी अत्यधिक लाभप्रद विचार करें। चूहों के अनुक्रमिक निगरानी एक समय पर ढंग से असफल प्रयोगों समाप्त के विकल्प के साथ, पर जल्दी उपन्यास उपचारों की प्रभावकारिता निर्धारित करने के लिए शोधकर्ताओं सक्षम बनाता है।भड़काऊ आंत्र रोग और कोलोरेक्टल कैंसर अग्रिम के बारे में हमारी समझ के रूप में, चिकित्सा के लिए नए लक्ष्य की पहचान की जाएगी। उपयुक्त पशु मॉडल सबसे होनहार नए उपचारों क्लिनिकल परीक्षण की ओर स्थानांतरित कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए अभिन्न हो जाएगा।
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank CSL Ltd. for supporting the purchase of the endoscopy equipment. The research in the laboratory of ME is supported by the Ludwig Institute for Cancer Research, and the laboratories of TP and ME are supported by the Victorian State Government Operational Infrastructure Support and the National Health and Medical Research Council of Australia. ME is an NHMRC Senior Research Fellow.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Dextran Sulfate Sodium (MW 36,000-50,000) | MP Biochemicals | 160110 | Requires batch testing. |
Azoxymethane | Sigma | A5486-100MG | Requires batch testing. |
Vanilla Protein Shake | N/A | N/A | Available from hospital pharmacies. |
Isoflourane | PPC | M60303 | This is a restricted reagent, which should be stored under lock and key. |
70% Ethanol | N/A | N/A | Standard lab reagent. |
Coloview miniendoscopic system | |||
Endovision Tricam | Karl Storz | 20212001-020 | |
Xenon 175 light source with anti-fog pump | Karl Storz | 20134001 | |
HOPKINS straight Forward Telescope | Karl Storz | 64301AA | |
Endoscopic Sheath (total diameter 3 mm) | Kalr Stroz | 61029C | |
Fubre Optic Light Cable | Kalr Stroz | 69495ND | |
Computer and media player software | MAC, imovies | ||
Scale | Any | Any scale suitable for weighing mice. |