Techniken für die Verarbeitung Augen mit einer Netzhautprothese für Implantierte Lokalisierte histopathologische Analyse: Teil 2 Epiretinale Implantate mit Retinal Tacks
Summary
Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis.
Abstract
Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices currently entering the market. In order to evaluate the safety of these devices, in preclinical studies, reliable techniques are needed. However, the hard metal components utilised in some retinal implants are not compatible with traditional histological processes, particularly in consideration for the delicate nature of the surrounding tissue. Here we describe techniques for assessing the health of the eye directly adjacent to a retinal implant secured epiretinally with a metal tack.
Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. The most commonly used location for implantation is the epiretinal location (posterior chamber of the eye), where the implant is secured to the retina with a metal tack that penetrates all the layers of the eye. Previous methods have not been able to assess the proximal ocular tissue with the tack in situ, due to the inability of traditional histological techniques to cut metal objects. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by tack insertion.
Therefore, we developed a technique for visualizing the tissue around a retinal tack and implant. We have modified an established technique, used for processing and visualizing hard bony tissue around a cochlear implant, for the soft delicate tissues of the eye. We orientated and embedded the fixed eye tissue, including the implant and retinal tack, in epoxy resin, to stabilise and protect the structure of the sample. Embedded samples were then ground, polished, stained, and imaged under various magnifications at incremental depths through the sample. This technique allowed the reliable assessment of eye tissue integrity and cytoarchitecture adjacent to the metal tack.
Introduction
Retinitis pigmentosa (RP) ist eine erbliche Erkrankung, die weitverbreitete Verlust von Photorezeptoren, die die Zellen in der äußersten Schicht der zur Transduktion Licht verantwortlich Retina verursacht, in der Form von Photonen, in neuronale Aktivität. Wichtig ist, dass Patienten mit RP haben typischerweise Rest Neuronen in den anderen Schichten der Netzhaut, die noch funktionsfähig sind. Netzhautprothesen zur Wiederherstellung einige begrenzte Vision für diese Patienten, indem sie auf diese überlebenden Neuronen mit elektrischer Stimulation ihrer Sehbahn 1,2 zu aktivieren. Perceptual Ergebnisse aus klinischen Studien haben gezeigt, viel versprechende erste Ergebnisse und vor kurzem einige Geräte sind für den kommerziellen Gebrauch zugelassen ist. Derzeit gibt es drei Haupt anatomischen Stellen, in denen klinische retinalen Prothesen positioniert worden: epiretinal 3,4, subretinal 5,6 und suprachoroidally 7,8. Verschiedene Geräte verwenden unterschiedliche Materialien und deren Form angepasst wirdan den Ort, in dem sie implantiert werden. Jedoch alle schaffen visuelle Wahrnehmungen durch Aktivieren der Rest Neuronen der Retina mit elektrischen Impulsen.
Es besteht die Möglichkeit für jede medizinische Prothese beschädigen umliegende Gewebe durch mechanische Einwirkungen des anfänglichen Platzierung oder die späteren laufenden Kräfte. Im Falle von implantierbaren Stimulatoren, wie Netzhautprothesen besteht die zusätzliche Überlegung, dass die elektrischen Parameter sollten innerhalb sicherer Grenzen liegen. Die Sicherheit der Patienten ist von größter Bedeutung, so dass Geräte müssen konsequent in präklinischen Studien, bevor zum klinischen Bereich 9-15 getestet werden. In unserem Begleiter Artikel beschrieben wir eine Methode zur Bewertung der lokalisierten Histopathologie des Auges ein Implantat in der Suprachoroidalraum 16 positioniert Umgebung. Im vorliegenden Manuskript beschreiben wir ein Verfahren zur Visualisierung von umgebenden eine Elektrodenanordnung an der Netzhaut angeheftet epiretinal, in einem präklinischen Augengewebe (zBLinie) Modell (Abbildung 1).
Die epiretinalen Lage ist die am häufigsten verwendete Position zur Lokalisierung eines Sehprothese. Elektrodenanordnungen hier entfernt werden typischerweise an der Netzhaut mit einer Metall Klebrigkeit, die alle Schichten des Auges eindringt 17-20 befestigt. Vor den in der vorliegenden Handschrift beschriebenen Techniken, war es schwierig, genau zu beurteilen die Netzhaut und anderen Geweben eine Wende in unmittelbarer Umgebung. Standard-Augenfixierung mit neutral gepuffertem Formalin führte artifactual Netzhautschäden durch die unterschiedliche Bewegung der Netzhaut und Lederhaut gegen die feste Spitze des Stifts. Daher ist jede tatsächliche Schaden durch die Klebrigkeit und epiretinalen Array verursacht nicht genau eingehalten werden. Zusätzlich könnte Schneiden des Augengewebes nicht mit der retinalen Klebrigkeit in situ durchgeführt werden, wie Metallgegenständen kann nicht ohne weiteres mit herkömmlichen histologischen Vorrichtung geschnitten werden; Entfernen der Heft vor histologische Verarbeitung war auchunerwünscht, da dies führte auch zu artifactual Netzhautschäden.
Das Ziel der vorliegenden Studie war zweifach: 1) zu einer Netzhautablösung Artefakt zu reduzieren, so dass keinerlei Einfluss auf die Klebrigkeit und das epiretinale Implantat Array verursacht verlässlich bewertet werden; und 2), um die Netzhautarchitektur benachbart zur Klebrigkeit, ohne es zu visualisieren. Um Ziel 1 zu erreichen, wurde eine neue Befestigungstechnik verwendet, die Artefakt retinale Ablösung reduziert (wie in der Begleiter Artikel 16 beschrieben). Um Ziel 2 zu erreichen, modifizierten wir eine Einbettung, Schleif-, und Poliertechnik, die ursprünglich für in situ Beobachtung der Cochlea-Implantat-Elektroden 21 bis 23 entwickelt. Die in dieser Handschrift beschriebenen Verfahren ermöglichen die Visualisierung der Netzhaut umgeben und grenzt an einer Wende in situ bei gleichzeitiger Minimierung artifactual Netzhautschäden und ermöglicht so eine genaue Abschätzung der möglichen Schäden, die durch die Klebrigkeit und epiretinalen Array verursacht.
Protocol
Representative Results
Discussion
Histologischen Standardtechniken sind nicht imstande, Hartmetallimplantate in situ Prozess wegen der Beschränkungen in Schneid diese Objekte mit Metall, Glas oder auch Diamantscheiben. In unserem Begleiter Papier 16 zeigten wir, daß die Verwendung einer modifizierten Vollaugenfixierung Technik könnte artifactual retinalen Delaminierung verringern. In der aktuellen Manuskript, ein etabliertes Schleif- und Poliertechnik zur Visualisierung Cochlea-Implantate in situ 21-23 wurde für die Netzhautprothesen modifiziert. Ein Titan-tack, verwendet werden, um eine Elektrodenanordnung auf die Netzhaut zu sichern, epiretinal wurde in Epoxidharz zusammen mit dem umgebenden Augengewebe eingebettet. Diese Harzblock wurde dann in geeigneter Weise, um die Gewebemorphologie unmittelbar angrenzend an die Metall tack offenbaren orientiert und schrittweise geschliffen / poliert. Bilder von der polierten Oberfläche des Blocks in verschiedenen Tiefen wurden mit einem leistungsstarken Dissektionsmikroskop gemacht. Diese Technik ist nützlich für: Visualisieren und evaluating die Gewebereaktion neben dem epiretinalen Implantats; um das Operationstrauma mit der Implantation des Implantats verbunden sind, bewerten; die biologische Reaktion auf die Hartmetallkomponenten zu bestimmen; und um den Abstand zwischen dem Implantat und der Oberfläche der Netzhaut zu messen.
Diese Technik wird in situ Visualisierung der Bereich in der Nähe einer Netzhaut-Tack oder andere harte (zB metallischen) Gegenstände in die Augen, die in Zukunft Sicherheitsstudien sein. Dies hat direkte Anwendung bei der Beurteilung der präklinischen Sicherheits Prothesen an der Netzhaut angeheftet epiretinal. Es kann auch nützlich für die Bewertung Gewebeschäden bei Retinabereiche in Kontakt mit Implantaten im subretinalen Stelle angeordnet sein.
Es gibt mehrere Möglichkeiten, um sicherzustellen, daß das Verfahren korrekt durchgeführt wurde. Bei jedem Schritt sollte die Netzhaut zu den äußeren Schichten des Auges befestigt bleiben. Wenn es Brutto artifactual Netzhautablösung kann dieser indischenaß ein Problem bei der Fixierung. Wenn die Probe eingebettet ist, und in der endgültigen Harz umorientiert blockieren die Retina sollte in der Nähe der Schleiffläche des Blocks orthogonal sein; dies Schrägschneid minimieren. Es ist nützlich, um zu überprüfen, dass die Anzahl der inkrementellen Schleifschritte (bekannter Schrittgröße), die für ein Objekt (wie ein Retina Klebrigkeit) durchlaufen entsprechend korrelieren mit den Abmessungen des Objekts.
Die Technik kann auf verschiedene Weisen optimiert werden. Kratzer auf der Oberfläche des mit der Schleifprozess verbunden Epoxydblock kann mit zunehmend feineren Poliergrad reduziert werden. Für die vorliegende Studie verwendeten wir 800, 1000, 1200, 2400, und 4000 Grad Siliciumcarbidpapier. Diamantpaste könnte auch verwendet werden, um die Oberflächenqualität zu verbessern. Eine feinere Oberflächengüte ergibt eine höhere Bildqualität, aber auf Kosten einer zusätzlichen Polierzeit. Ein weiterer kritischer Betrachtung zur Verbesserung der Ergebnisse dieser Technik ist die Auswahl und Qualität des optics und Beleuchtung für die Bildaufnahme verwendet. Andere histologische Grundflecken – besonders Nissl Flecken, kann anstelle von Toluidinblau verwendet werden, jedoch kann eine weitere Optimierung erforderlich. Einige Flecken wird das Harz als auch das Gewebe (zB Eosin), daher kann eine flache Lack nach der Färbung erforderlich ist, um Hintergrundfärbung zu entfernen Fleck. Spezialisierte Flecken, Fluoreszenzfarbstoffe und immunhistochemischen Färbung wurde nicht versucht, aber wenn ein sehr spezifisches Ergebnis erwünscht ist, ist die erforderliche Zeit, um diese Flecken an jedem Schleifebene ausführen wahrscheinlich unerschwinglich. Jedoch kann es möglich sein, das Gewebe als Ganzes vor dem Einbettungsschritt (Schritt 3.4) 24 zu färben.
Die Haupteinschränkung dieser Technik ist, dass, sobald der interessierende Bereich wurde abgeschliffen, nicht wiederhergestellt werden können, ist es daher ratsam, viele (möglicherweise redundant) Bilder mit einer Vielzahl von Vergrßerungen in jeder Stufe des Schleifens und Polierens zu erfassen. Es istauch wichtig, in kleinen Schritten für jeden Schleiftiefeneinstellung zu verwenden. Eine weitere Einschränkung dieses Verfahrens ist, dass von der optischen Vergrßerung und Auflösung im Vergleich mit dem Gewebe auf einem Glasträger befestigt und mit einem Standard (Transmission) Lichtmikroskop betrachtet. Für die Zwecke des Prototyping und Bewertung der Sicherheit eines neuartigen Implantatvorrichtung ist von primärem Interesse der pathologische Auswertung. Dieses Verfahren stellt eine effiziente Methode zur Beobachtung der klinisch relevanten Schäden mit einer Retina Klebrigkeit verbunden. Mit etwas Übung die Gesamtzeit zum schleifen, polieren zu sammeln und zu fotografieren eine gegebene Probe (einmal eingebettet) ist vergleichbar mit der Zeit würde es dem Kapitel einen Paraffinblock oder Gefrierschnitt zu nehmen.
Es besteht auch das Potential für die vorliegenden Techniken auf Anwendungen außerhalb des Bereichs der Netzhautimplantate verlängert. Diese Technik ist für die Bewertung des Gewebes angrenzend an eine Fest Implantat gegebenen Implantat Extraktion nicht geeignet feasible oder würde die Schnittstelle beschädigt werden. Zum Beispiel könnte diese Technik erweitert werden, um Implantate aus Metall (beispielsweise Platin, Nitinol, etc.), die nicht mit herkömmlichen histologischen Verfahren geschnitten werden können, hergestellt werden, zu bewerten, wie einige tiefe Gehirn oder peripheren Nervenelektroden, Kanülen für die Arzneimittelabgabe, Gefäßstents oder orthopädische Prothesen.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nicole Vella (Macquarie University) for providing reagents; Alexia Saunder (Bionics Institute; BI), Michelle McPhedran (BI), Chris Williams (BI) for experimental support; the Royal Victorian Eye and Ear Hospital (RVEEH) Biological Research Centre staff for animal care; Sue Pierce (RVEEH) for veterinary advice; Anthony Burkitt (Bionic Vision Australia; BVA), Tamara Brawn (BVA) and the BVA staff for administrative support.
This research was supported by the Australian Research Council (ARC) through its Special Research Initiative (SRI) in Bionic Vision Science and Technology grant to Bionic Vision Australia (BVA). The Bionics Institute receives Operational Infrastructure Support from the Victorian Government and also acknowledges support from the Bertalli Family Trust and the J T Reid Charitable Trust. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
The Bionic Vision Australia Consortia authors for this manuscript are (a-z):
Penelope J. Allen, Owen Burns, Kate E. Fox, Kumaravelu Ganesan, David J. Garret, Hamish Meffin, Joel Villalobos, and Jonathan Yeoh.
Materials
| Name of the reagent / equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Acetone | Chem-Supply | AA008 | Propanone BHD Medical grade |
| Epo-Tek 301 Epoxy | Epoxy Technology | Part A 1675-54-3 Part B 9046-10-0 | |
| Ethanol 70-75% v/v | Merck PTY LTD | 4.10261 | Alcohol |
| Ethanol | Merck PTY LTD | 90143 | Alcohol |
| Toluidine blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| TegraPol grinding/polishing machine | Struers | TegraPol-25 | |
| AccuStop specimen holder | Struers | Accustop | |
| Light microscope | Leica | MZ16 | |
| Objective lens | Leica | 2.0x Planapo Objective | |
| Digital Microscope Camera | Leica | DFC-420C | |
| Microscope Software | Leica | Application Suite v4.1.0 |
Riferimenti
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