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Neuroscienze

Microdisección de captura por láser - Una demostración del aislamiento individual de dopamina neuronas y el Área ventral tegmental completo

Published: February 06, 2015
doi:
10.3791/52336
, ,
1Department of Basic Sciences,Mississippi State University College of Veterinary Medicine

Summary

El aislamiento de las neuronas de dopamina individuales o el área tegmental ventral con inmunohistoquímica directa o indirecta se demuestra utilizando láser captura microdissection. Se discuten los parámetros para el aislamiento de tejido de un portaobjetos de vidrio usando un láser de infrarrojos y a partir de diapositivas membrana utilizando la combinación de un láser infrarrojo y ultravioleta.

Abstract

Microdisección de captura por láser (LCM) se utiliza para aislar una población concentrada de células individuales o regiones anatómicas precisos de tejido de secciones de tejido sobre un portaobjetos de microscopio. Cuando se combina con la inmunohistoquímica, LCM se puede utilizar para aislar tipos de células individuales basándose en un marcador de proteína específica. Aquí, la técnica LCM se describe para la recogida de una población específica de las neuronas de dopamina marcadas directamente con inmunohistoquímica de tirosina hidroxilasa y para el aislamiento de la neurona de dopamina que contiene la región de la zona tegmental ventral usando inmunohistoquímica indirecta tirosina hidroxilasa en una sección adyacente a los utilizados para LCM. Una de infrarrojos (IR) de captura de láser se utiliza tanto para diseccionar las neuronas individuales, así como el área tegmental ventral fuera portaobjetos de vidrio y en una tapa de LCM para el análisis. Deshidratación completa del tejido con etanol 100% y xileno es crítica. La combinación de la captura láser IR y el ultravioleta (UV) cutting láser se utiliza para aislar las neuronas de dopamina individuales o el área tegmental ventral utilizando las diapositivas de membrana PEN. Una diapositiva membrana PEN tiene ventajas significativas sobre un portaobjetos de vidrio, ya que ofrece una mejor consistencia en la captura y la recolección de células, está recogiendo más rápido de grandes piezas de tejido, es menos dependiente de la deshidratación y los resultados en la eliminación completa del tejido de la diapositiva. Aunque la eliminación de grandes áreas de tejido de un portaobjetos de vidrio es factible, es considerablemente más tiempo y con frecuencia deja algo de tejido residual atrás. Los datos mostrados aquí demuestran que el ARN de cantidad y calidad suficientes se puede obtener utilizando estos procedimientos para mediciones de PCR cuantitativa. Aunque ARN y ADN son las moléculas más comúnmente aisladas de tejido y células recogidas con LCM, el aislamiento y la medición de microARN, proteínas y cambios epigenéticos en el ADN también pueden beneficiarse de la resolución anatómica y celular mejorada obtenida usando LCM.

Introduction

Todo el tejido se compone de una población heterocigotos de las células. Esto es particularmente relevante para el tejido cerebral, que consta de varias neuronas morfológicamente y / o neuroquímicamente distintas rodeadas por varios tipos de células gliales (oligodendrocitos, astrocitos y microglia). Además, distintas regiones en el cerebro, tales como áreas de la corteza del tronco cerebral o núcleos, tienen funciones específicas. Por lo tanto, la capacidad de aislar poblaciones específicas de células o áreas muy pequeñas anatómicamente distintos, cuando se combina con técnicas de análisis (es decir, Q-PCR, microarrays, ARN de secuenciación, y la proteómica), puede mejorar notablemente la comprensión de diversos procesos biológicos. LCM es una tecnología que proporciona la capacidad para aislar áreas anatómicas muy discretas o células específicas a partir de tejido sobre un portaobjetos de microscopio de proporcionar una fuente mucho más homogénea para su posterior análisis de diversas moléculas, tales como ARN, microARN, el ADN y las proteínas.

t "> Desde LCM se introdujo primero, varios enfoques diferentes se han utilizado para microdissect células a partir de tejido 1-3. Los primeros enfoques incluyen la unión directa de tejido sobre un portaobjetos utilizando un (IR) láser infrarrojo y una película termoplástica y un no método de contacto utilizando una luz ultravioleta (UV) de corte láser para separar una célula o tejido y recogida en un tubo. Posteriormente, LCM ha sido utilizado con éxito en una variedad de tejidos y tipos celulares y se muestra para que sea compatible con el aislamiento de varias moléculas para el análisis de aguas abajo incluyendo ARN, microARN, ADN y proteínas, incluyendo la actividad enzimática 1,4-7. Aquí LCM se demuestra mediante la LCM un sistema que utiliza un láser UV de corte y un láser IR de captura para el corte alrededor de las células o el tejido y lo conecta a una tapa de LCM, respectivamente. Este sistema LCM utiliza tanto la captura láser IR para fundir una película de plástico en una tapa sobre la célula o tejido de interés que se une a las células a la película de plástico y lo elimina de tque el tejido con la retirada de la tapa (Figura 1). Además, en combinación con el láser IR, un láser UV está disponible para recorte de células de interés de montaron en portaobjetos con una membrana entonces aislado uniendo el tejido a la tapa LCM utilizando el láser IR (Figura 2) de tejido o tejido. Una breve descripción de estas técnicas se encuentra en las Figuras 1 y 2.

Varias variaciones sobre esta técnica se describen a cualquiera de aislar las células específicas mediante inmunohistoquímica de fluorescencia directa y una técnica inmunohistoquímica indirecta guiada que se utiliza para el aislamiento de una región de tejido basado en la expresión de una proteína específica. Específicamente, se muestra el aislamiento de las neuronas de dopamina de la sustancia negra y el aislamiento de la zona tegmental ventral y el posterior aislamiento de ARN a partir de, el tejido cerebral fresco congelado. Como ARN es el más lábil de moléculas medidos (en comparación con el ADN o proteína), steps para ayudar a preservar la integridad del ARN se incluyen y los datos mostrados en la cantidad y calidad del ARN obtenido.

Protocol

NOTA: El tejido cerebral de ratones se utilizó de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, y los protocolos de estudio fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional en la Universidad Estatal de Mississippi. 1. Preparación de las diapositivas y Tejidos Para ello puede utilizar las diapositivas de silano-prep o naftalato de polietileno (PEN) portaobjetos de vidrio de membrana. Para el aislamiento de ARN, se desliza por inmersión en solución de descontaminación RNasa, se lavan 3 veces con agua libre de RNasa luego se deshidratan con una serie graduada de RNasa libre de etanol y de vacío en seco durante 30 minutos. Cortar secciones de tejido a las 10 micras de espesor usando un criostato y montar en los RNasa diapositivas gratuitas preparadas. Mantenga las secciones congeladas durante el corte para preservar la calidad del ARN. NOTA: Asegúrese de que el tejido es de aproximadamente 4 mm de los bordes de la diapositiva como la LCM no puede eliminar el tejido que está demasiado cerca de los bordes de la diapositiva. En order para retirar el tejido de una diapositiva membrana PEN, asegúrese de que el tejido es de 4 mm de la izquierda, arriba y abajo y 7 mm de la parte derecha de la diapositiva que son las dimensiones de la membrana que no está conectado a la diapositiva. Para el aislamiento de las poblaciones de células individuales mediante inmunohistoquímica directa, tejido sección en cualquiera de las diapositivas-silano preparación o diapositivas membrana PEN. Para el aislamiento de las regiones de tejido utilizando técnicas de inmunohistoquímica indirecta guiadas, montar un conjunto de secciones sobre un portaobjetos de silano-prep para inmunohistoquímica y secciones alternas en cada una diapositiva membrana PEN y / o una diapositiva-silano de preparación que se utilizará para LCM. 2. Preparación de tejidos para la captura láser – Rapid tirosina hidroxilasa inmunohistoquímica para la captura láser directa de las células inmunorreactivas Esquema tejido con un lápiz hidrofóbico y deje secar. Fijar un tejido en acetona-metanol (1: 1) solución a -20 ° C durante 10 min. NOTA: Our experiencia ha demostrado que la fijación de acetona-metanol resultó en inmunohistoquímica mucho más consistente que la acetona o metanol solo. Enjuagar portaobjetos en tampón fosfato salino (PBS) con 1% de Triton (libre de RNasa). Secciones de cubierta con 100-200 l de PBS con 1% Tritón con anticuerpo tirosina hidroxilasa diluyeron 1: 100 con 400 U / ml RNasin. Incubar durante 5 a 10 min. Enjuague brevemente en PBS dos veces y PBS-1% Tritón. Cubrir el tejido con 100-200 l de anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo marcado con Alexa Fluor 488 diluido 1: 100 en PBS-1% de Triton con 400 U / ml RNasin y 50 ng / ml DAPI. Incubar durante 5 min. Enjuague 2 veces en PBS luego deshidratar 30 s en una serie graduada de RNasa libre de etanol (75% -75% -95% -95% -100% -100%). Incubar en dos lavados de xileno durante 1 min y después 5 min. Retirar los portaobjetos de xileno inmediatamente antes de su uso para el LCM y dejar secar al aire. 3. Preparación de tejidos para la captura láser – TirosinaHidroxilasa inmunohistoquímica para la captura láser indirecta de Inmunorreactiva Regiones Proceso de una diapositiva con secciones adyacentes a las secciones montado en silano preparación y / o PEN diapositivas de membrana para inmunohistoquímica. NOTA: Procedimientos utilizados aquí son similares a los reportados previamente 5. Para las imágenes de demostración, se utilizó la diaminobencidina (DAB) cromógeno reacción para visualizar las neuronas tirosina hidroxilasa de interés. Para diapositivas utilizadas para LCM, fijar durante 5 minutos en acetona al 100% a 4 ° C. Deshidratar tejido en una serie graduada de RNasa libre de etanol (75% -75% -95% -95% -100% -100%) durante 1 min cada uno. Incubar en dos lavados de xileno durante 1 min y después 5 min. Retirar los portaobjetos de xileno inmediatamente antes de su uso para el LCM y dejar secar al aire. 4. Uso del sistema de microdisección de captura por láser NOTA: El programa de aplicación LCM tiene 10 barras de herramientas y 2 ventanas para controlar laprocedimiento de microdisección. Barras de herramientas: 1. Microscopio, 2. Láser Captura, 3. El corte por láser, 4. Estudio, 5. Navegación, 6. Materiales, 7. Grupos de captura, 8. microdisección, 9. Font, 10. Anotación. Windows: 1. Live Video y 2. Hoja de Ruta. Abre la puerta al seleccionar la pestaña "Puerta abierta" en la barra de herramientas Materiales en el software del sistema LCM. Diapositivas de carga en las tres ranuras disponibles. Para esta demostración, cargue una diapositiva con inmunohistoquímica tirosina hidroxilasa visualiza con DAB, una diapositiva-silano de preparación y uno PEN diapositiva membrana cada uno marcado por un rápido tirosina hidroxilasa fluorescentes inmunohistoquímica. En un experimento típico, utilizar secciones fijas ya sea acetona no marcado con un tobogán de referencia marcado para la tirosina hidroxilasa utilizando DAB o diapositivas marcadas directamente con tirosina hidroxilasa fluorescente para la captura de láser. Cargue las tapas de LCM en la ranura disponible. NOTA: tapas Macro y HS LCM están disponibles para su uso. El tipo de tapa LCM utilizar dedepende de la cantidad de células o cantidad de tejido a cobrar. Diapositivas Macro se enumeran a obtener hasta varios miles de células, mientras que las tapas del SA pueden recoger varios cientos. Las diapositivas Macro permiten más la recogida de tejidos, pero requieren 50 l de tampón de lisis. La tapa HS, cuando se utiliza con los adaptadores, requiere sólo 10 l de tampón de lisis que permite una mayor recuperación proporcional de ARN. Cierre la puerta. Cargue la diapositiva para activar la ventana Hoja de Ruta que proporciona una vista de trabajo de toda la diapositiva, esto permite la selección de la región de interés (Figura 3). Ver la hoja de ruta en la ventana de vídeo en directo para desplazarse a la zona de interés. En la barra de herramientas Materiales, identificar las diapositivas de membrana PEN marcando la casilla encima de la ranura de deslizamiento. Para el suministro de propiedades capitalización, haga clic derecho sobre las tapas en la barra de herramientas Materiales y seleccionar "Propiedades de suministro Cap". Marque las casillas que indican la posición de las tapas y seleccione Macro o HS gorras. Seleccione la pestaña "fluorescencia" en la barra de herramientas del microscopio para encender la lámpara fluorescente y que la lámpara fluorescente se caliente. Usa los filtros azul y UV para visualizar el Alex Fluor 488 y DAPI, respectivamente. Utilice la ficha "Ajuste Cámara" para aumentar la sensibilidad de la imagen con el fin de ver las células marcadas con fluorescencia. En la barra de herramientas materiales, haga clic derecho en una gorra y moverlo a la diapositiva de interés. Haga doble clic en una ubicación en la hoja de ruta para seleccionar la región que aparece en la ventana de vídeo en directo. Mueva la tapa alrededor de la diapositiva puede seleccionar un área en la Hoja de Ruta (doble clic izquierdo) y luego hacer clic derecho y seleccionar "tapa Place en la región central." Antes de utilizar el láser captura IR, apuntar y ajustarlo para la fuerza. Coloque la tapa en una región de la corredera de distancia a partir de tejido. En la barra de herramienta láser de captura, seleccione "Habilitar". Ajuste la alimentación (3-100 mW), Pulso (100-1000000 μ; Seg) y # Golpea del láser. Disparar el láser IR cuando la tapa es sobre una parte de la diapositiva sin tejido y comprobar para ver si el láser derrite suficientemente la membrana tapón LCM. NOTA: Esto se llama humectante que se está derritiendo la membrana de polímero en la tapa de modo que haga contacto con la placa de vidrio. Humectación suficiente es visible como un anillo oscuro fusionado a la corredera con el centro del anillo claro (Ver Figura 4 para ejemplos de suficiente e insuficiente de fusión). Si humectación no es suficiente, ajustar la potencia y el pulso, y el fuego de prueba hasta que esto se logra. Además, también se pueden usar múltiples incendios del láser. Cuando se ajusta la intensidad del láser de infrarrojos, haga clic derecho y seleccione "láser captura está aquí" para apuntar el láser. NOTA: Este paso le dice a la computadora donde el láser IR captura está dirigido a los tejidos. Este paso de apuntar el láser es crítica y necesita ser repetido cada vez que la tapa se mueve o se cambia el objetivo. </ol> Microdissection Capture 5. Láser de neuronas de dopamina individual fuera de Diapositivas-silano prep Mover a la región de interés para capturar células. NOTA: El ejemplo de aislamiento de las neuronas de dopamina se muestra aquí. Para capturar las células individuales fuera de una diapositiva-silano preparación, seleccione la pestaña "LCM", luego el icono de "punto único" en la barra de herramientas Microdissection. En la barra de herramientas del microscopio, utilice la ficha "disparador" para cambiar entre fluorescencia y campo claro con filtros fluorescentes pestañas para elegir los filtros adecuados y utilice las pestañas objetivos para cambiar la ampliación. Una vez que las células de interés son visibles en la ventana de vídeo en directo, ajuste el tamaño del punto utilizado para marcar las células de interés para el tamaño aproximado de las células. Haga esto haciendo clic en la ficha Punto de la barra de herramienta láser captura luego haciendo clic en uno de los lados de una célula manchado, seguido haciendo clic en el lado opuesto. NOTA: Este calcula eldiámetro de la mancha y muestra el valor. Marque las células de interés haciendo clic en ellos mientras se selecciona el icono de "punto único". Haga esto para colocar un marcador lugar en cada célula. Aquí, el filtro azul y el objetivo de 10X se utilizan para visualizar las neuronas de dopamina. Vuelva a probar y apuntar el láser de infrarrojos de la tapa donde no hay tejido debajo de ella, como se describe en los pasos 4.9 y 4.10. Una vez que las células están marcados, seleccione "Ir – corte y captura" pestaña en la barra de herramientas Microdissection y el láser de infrarrojos se disparará automáticamente células en absoluto marcados seleccionados. Además, si es necesario, disparar el láser IR manualmente en cualquier punto de interés (Figura 5D). Mover la tapa lejos de la sección y en una región abierta de la corredera para comprobar si se capturaron las células sobre el casquillo de LCM. Asegúrese de que las células de interés se eliminan de la corredera (Figura 5B, E) y unidos a la tapa LCM (Figura 5C, F). º Documentoes proceso haciendo clic en la pestaña "Captura de imagen" en la barra de herramientas del microscopio. Cuando haya terminado la recolección de tejido, retire la tapa haciendo clic derecho sobre la tapa y seleccione "Mover a" y luego "Descargar". Captura 6. Láser de dopamina individual neuronas fuera del PEN Membrana Diapositivas Para capturar las células individuales fuera del PEN diapositivas membrana utilizando tanto los láseres IR y UV, seleccione "Cortar y Capture" pestaña en la barra de herramientas Microdissection. Seleccione la pestaña "punto único" para marcar las células de interés. Utilice la ficha "línea de corte" para delinear cada celda. Asegúrese de probar el láser IR como se describe en el paso 4.9 y 4.10 y probar el láser UV para determinar la intensidad mínima necesaria para cortar pensó el PEN membrana y el tejido (Figura 4 y 5) Seleccione la opción "Captura y Cut" pestaña en la barra de herramientas Microdissection. Cuando la recolección de células individuales utilizando esta técnica, seráAsegúrese de disparar el láser IR primero seguido por el láser UV como estas pequeñas piezas se pueden perder si se cortan antes de ser colocada en la tapa de LCM. NOTA: Este proceso también se puede hacer manualmente por el disparo del láser IR en un punto de interés y las células se indica de forma individual con el láser UV. Después de recoger las células de interés, mover la tapa LCM como se describe anteriormente en el paso 5.7 para determinar si fueron retirados y unidos a la tapa (Figura 6) de las células. Cuando haya terminado la recolección de tejido, retire la tapa haciendo clic derecho en la tapa y seleccionar "Mover a" y luego "Descargar". 7. La captura de la tegmental ventral de Diapositivas Silano-prep Para identificar la región de interés, utilice la diapositiva procesados ​​para inmunohistoquímica. NOTA: Para esta demostración del área tegmental ventral está aislado (Figura 7A). Cargar un tapón LCM y probar el láser como en el pasos 4,9 y 4,10. NOTA: Por lo general, una gorra LCM macro se utiliza pero una tapa HS también se puede utilizar (Ver Figura 8). Para aislar una región de tejido (es decir, el área tegmental ventral) de la diapositiva-silano preparación, seleccione la pestaña "LCM" en la barra de herramientas Microdissection, a continuación, seleccione la pestaña "polígono exterior". Delinear la región de interés en la ventana de vídeo en directo. Dependiendo del tamaño de la zona para la recogida, delinear la región de interés a bajo aumento (objetivo 2x). Para la recolección, sin embargo, el instrumento utiliza el objetivo de 10X así ajustar y apuntar el láser IR bajo el objetivo de 10X antes de la captura. Seleccione la opción "Ir – captura y corte" pestaña en la barra de herramientas Microdissection. NOTA: El equipo se disparará automáticamente el láser de infrarrojos en todo el área seleccionada (Figura 7F, I). Si la membrana LCM no se ha derretido lo suficiente en toda la zona, el láser puede ser disparado hombredualmente o de todo el proceso se repite. Mueva el tapón LCM fuera del tejido para determinar lo bien que se recogió el tejido. NOTA: Un pase de utilizar este método normalmente deja algo de tejido detrás de la diapositiva (Ver Figure7G). Si esto ocurre, repita la selección y capturar paso anterior. La repetición de este paso se puede aumentar la cantidad de tejido recogido (Figura 7J). Cuando haya terminado la recolección de tejido, descargue la tapa haciendo clic derecho en la tapa y seleccionar "Mover a" y luego "Descargar". 8. Capturar el área tegmental ventral del PEN Membrana Diapositivas Utilice el portaobjetos procesados ​​para inmunohistoquímica como una guía para seleccionar la región de interés a partir del tejido en la diapositiva membrana PEN como anteriormente. Seleccione la pestaña de "Corte y Capturar" en la barra de herramientas Microdissection. Seleccione la pestaña "Cut Line" y delinear la región de interés mediante el immunohistocheMistry etiquetado de diapositivas como una guía. NOTA: El programa añadirá automáticamente puntos para el láser de infrarrojos para conectar el tejido a la tapa. Utilice la pestaña "punto único" para agregar puntos adicionales para asegurar mejor el tejido a la tapa. Con arreglo al objetivo, el fuego de prueba 10 veces y apuntar el láser IR y UV como se describe en 4.9 y 4.10. Prueba de que el láser UV puede penetrar la membrana de la diapositiva y que este recorte corresponde a la ubicación en la pantalla del ordenador. Utilice una fuerza láser UV que es justamente suficiente para cortar la membrana y el tejido, pero no daña el tejido (Figura 5). Seleccione la opción "Ir – captura y corte" pestaña en la barra de herramientas Microdissection. NOTA: El equipo se disparará automáticamente el láser IR en todos los puntos marcados en el tejido para adjuntarlo a la tapa y luego disparar el láser UV para reducir la diapositiva membrana PEN y el tejido (Figura 7C). Puntos derretidos IR adicionales pueden ser necesarias para fijar adecuadamente el tisdemandar a la tapa del LCM, que también se puede agregar manualmente. Mueva el tapón LCM fuera del tejido para determinar si el tejido se retiró de la sección (Figura 7C) y unido a la tapa (Figura 7C). Cuando haya terminado la recolección de tejido, para retirar la tapa, haga clic derecho en la tapa y seleccione "Mover a" y luego "Descargar". 9. Aislamiento de ARN Para recoger el ARN de las células o tejido capturados, se incuba la membrana de la tapa LCM en tampón de lisis de ARN durante 30 min a 37 ° C. NOTA: Para tapas de HS, un adaptador está disponible que permite el uso de sólo 10 l de tampón de lisis en la tapa y se conecta a un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml. Las tapas Macro requieren 50 l de tampón de lisis y se conecta directamente a un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml. Después de la incubación, el tampón de lisis girar hacia abajo en el tubo de microcentrífuga de 0,5 ml. Para asegurar la lisis completa de todas las células otejido r, la cáscara de la membrana de la tapa LCM de la tapa y el lugar en el tampón de lisis. Para probar la integridad del ARN, el uso de ARN aislado del tejido restante en la diapositiva después LCM para medir la integridad del ARN. NOTA: Debido a la ARN limitado de la muestra obtenida con LCM, que típicamente no es práctica para probar la integridad del ARN en ARN aislado LCM, sin embargo, el ARN a partir del tejido restante proporciona un buen indicador de cualquier degradación del ARN debido a la fijación, inmunohistoquímica y el tiempo durante el procedimiento LCM.

Representative Results

La micrografía en las Figuras 6 y 7 demostrar las capacidades para el aislamiento de las neuronas de dopamina individuales. La resolución anatómica actual es de alrededor de 5-10 micras como el tamaño de punto más pequeño que se puede producir consistentemente en la LCM tapas para aislar una célula. La única limitación para el aislamiento de tipos de células específicas es la capacidad de visualizar las células. Aunque LCM es capaz de aislar las neuronas de dopamina individuales, la contaminación de partes de células no marcadas adyacentes más probable se produce. Por lo tanto, la muestra final es una colección concentrada de las neuronas de dopamina, no una población pura de las neuronas de dopamina. Esta tecnología también es capaz de aislar pequeñas áreas de tejido, tales como núcleos discretos o regiones en el cerebro como se muestra con el aislamiento de la zona tegmental ventral. Publicaciones anteriores han demostrado este uso en el tejido cerebral, así como para aislar tejido patológico del tejido normal 5,11. <pclass > Debido a que el uso más común de células y tejidos aislados usando LCM es el análisis de ARN, los procedimientos presentados fueron optimizados para preservar la integridad del ARN. Con el fin de determinar la calidad del ARN que quedaba después de LCM, se aisló ARN, usando columnas de centrifugación a base de sílice, a partir de tejido en los portaobjetos siguientes LCM, ya sea después de que el procedimiento de la tirosina hidroxilasa rápida fluorescente inmunohistoquímica o la fijación en acetona. ARN de calidad se mide y compara con los valores de ARN a partir de ARN comercialmente disponible total del cerebro (Figura 9). La calidad del RNA se redujo en las muestras de ARN de tejidos utilizados para LCM con integridad más baja después de inmunohistoquímica (RIN no disponible) seguido por acetona fijación (RIN 2,6) en comparación con ARN total del cerebro (RIN 8.2) como se puede ver por una reducción relativa en altura del pico de rRNA S28 en comparación con el pico S18. Sin embargo, el ARN mantiene las bandas 18S y 28S y la expresión de genes podría medirse usando Q-PCR. <p class= "Jove_content"> Para medir la cantidad de ARN obtenido a partir de neuronas adquiridos a través de LCM, las neuronas de dopamina (50, 100 y 200 neuronas de dopamina) se aislaron de la zona tegmental ventral fuera de diapositivas Silane-Prep. Se aisló el ARN usando columnas de centrifugación a base de sílice y se midió la cantidad de ARN. Sobre la base de la curva estándar generada, se aisló un total de 17,3, 24,8 pg y 50,9 pg / l de 50, 100 y 200 neuronas de dopamina, respectivamente (Figura 10A). Para medir la cantidad de ARN con Q-PCR, un rango de concentraciones de ARN total del cerebro y el ARN de las neuronas de dopamina se transcribe de forma inversa y el gen de β-actina se midió usando Q-PCR como se describe anteriormente 5. Sobre la base de estas mediciones, una concentración de 3,55, 6,82 y 20,58 pg / l se calcula a partir de 50, 100 y 200 neuronas de dopamina, respectivamente (Figura 10B). Para demostrar cómo el aislamiento de las neuronas de dopamina se compara con el aislamiento de todo el várea tegmental entral con LCM, genes específicos de neuronas de dopamina (Nurr1, la tirosina hidroxilasa, y transportador de dopamina) se midieron con Q-PCR en estos dos tipos diferentes de muestras y se compararon con la expresión de β-actina (Figura 11). Dado que los valores t reducción de C se generan con una mayor concentración del gen de interés, una disminución en el? C t indica un incremento en la expresión de los genes de las neuronas de dopamina en relación con β-actina. Esto demuestra cómo el aislamiento de las neuronas de dopamina individuales concentra la expresión de genes específicos de neuronas de dopamina. En las muestras de área tegmental ventral, los genes específicos de neuronas dopaminérgicas se diluyen como otras células (neuronas no dopaminérgicas y las células gliales) también serán recogidos que expresan β-actina, pero no expresan genes de neuronas de dopamina. <strong> Figura 1. captura de láser usando el láser de infrarrojos (IR) de captura. La pequeña tapa de LCM de plástico tiene una membrana en la parte inferior que se coloca en la parte superior de montado sobre un portaobjetos de vidrio (Paso 1) de tejido. Cuando se identifica el tejido o célula de interés, un láser de captura de IR es disparado a través de la tapa de LCM para fundir una pequeña hoyuelo en la membrana sobre el tejido / célula subyacente (Paso 2). Cuando se retira la tapa de LCM, el tejido se retira del portaobjetos de microscopio y permanece unida a la tapa LCM. Figura 2. captura de láser utilizando el infrarrojo (IR) láser de captura y el ultravioleta (UV) de corte láser. Con el fin de adquirir grandes áreas de tejido o facilitar la recuperación de las células utilizando el láser UV, el tejido se monta sobre un portaobjetos con una membrana conectado a la corredera a lo largo de la esquina exterior (diapositivas de membrana PEN). El tapón LCM se coloca en tque el tejido y el láser IR de captura se utiliza para fundir la membrana de la tapa y coloque el tejido a la tapa LCM (Paso 1 y 2). El láser de corte UV se utiliza para cortar a través de la membrana de diapositivas y el tejido (paso 3 y 4) de modo que cuando se retira la tapa el tejido se elimina de la corredera y permanece en la tapa de LCM (Paso 5). Figura 3. La captura Laser Microdisección Sistema de Hoja de Ruta. Este Sistema de microdisección de captura por láser tiene espacio para 3 diapositivas a la vez. Cuando diapositivas se cargan en el microscopio, se generan bajo aumento Hoja de Ruta imágenes para cada diapositiva. Al seleccionar una zona de la imagen hoja de ruta se mueve la ventana Imagen en directo a esa región. Para fines de demostración, el mesencéfalo ratón fue seccionado en 10 micras en la sección 3 toboganes. La primera diapositiva se marcó para tirosina hidroxilasa immunoreactiviTy utilizando diaminobenzidina como un cromógeno (A). Las secciones fueron montadas en cualquiera de diapositivas Silano-Prep (B) o diapositivas membrana PEN (C). Ambos de estas diapositivas fueron etiquetados utilizando el rápido fluorescentes inmunohistoquímica tirosina hidroxilasa. Las flechas en (C) indican la unión de la membrana PEN al portaobjetos de vidrio. No tejido fuera de esta frontera se pueden recoger con LCM. Figura 4. Usando el láser de captura de IR. El láser IR de captura se utiliza para fundir la membrana de la tapa LCM para unir el tejido a la tapa de LCM y retire del resto del tejido. El láser de captura de IR debe ser de al fuerza suficiente para fundir la membrana de la tapa LCM suficientemente en contacto con el tejido y portaobjetos de vidrio subyacente. La imagen de arriba muestra cuando el láser no fue suficiente para derretir la membranaa la diapositiva (dejado dos puntos). Cuando la membrana derretido toca el portaobjetos de vidrio, un grueso contorno negro se puede observar (lugar correcto). La intensidad del láser se puede ajustar cambiando la alimentación (3-100 mW), Pulso (100-1,000,000 microsegundos) y # éxitos de los láser. Además, repetida disparo del láser IR en el mismo lugar también se puede fundir adicionalmente la membrana. El objetivo del láser IR necesita ser ajustado en cualquier momento el tapón LCM se mueve o cuando se cambia el objetivo. Barra de escala = 100 micras. Figura 5. Uso de la UV corte por láser. El láser de corte UV se utiliza para cortar a través de la membrana de PEN y el tejido. Antes de utilizar la intensidad mínima necesaria para cortar a través de la membrana y el tejido que se debe determinar ya que el láser UV puede dañar el tejido. Arriba, los tres puntos (flechas) de diferentes intensidades de láser UV se muestran con el tamaño de punto izquierdo suficiente para 10 micras secciones, el punto medio para las secciones más gruesas y el punto derecho que demuestra una intensidad de láser UV que es demasiado alto. Barra de escala = 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 6. aislamiento directo de la tirosina hidroxilasa neuronas inmunorreactivas utilizando el láser de IR. Neuronas de dopamina se muestran después de un marcaje fluorescente rápida para la tirosina hidroxilasa (A). Cuando el láser de IR se dispara la fusión de la membrana de la tapa LCM sobre estas neuronas (D), extracción de la tapa recoge estas células fuera de la corredera (B, E). Estas neuronas se pueden visualizar como adjunto a la tapa LCM (C, F). Barra de escala = 250 micras.= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/52336/52336fig6large.jpg" target = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 7. aislamiento directo de la tirosina hidroxilasa neuronas inmunorreactivas a partir de diapositivas de membrana pluma utilizando los láseres IR y UV. Tirosina hidroxilasa neuronas marcadas se muestran por encima de (A). Estas neuronas se pueden unir a la tapa LCM utilizando el láser IR y se cortan desde la diapositiva membrana PEN utilizando el láser UV (B). Barra de escala = 250 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 8. indirecta aislamiento de la zona tegmental ventral utilizando tirosina hidroxilasa inmunoreactividad. La ubicación de las neuronas dopaminérgicas en el área tegmental ventral se visualizó en una sección usando técnicas de inmunohistoquímica estándar (A y E). Esta sección etiquetada inmunohistoquímica se utilizó como una plantilla para localizar el área tegmental ventral en las secciones adyacentes no teñidas (B y F). Usando el láser UV, el área tegmental ventral estaba unido a la tapa LCM con el láser IR y se cortan de la corredera con el láser UV (C y D) y se muestra unido a una tapa HS LCM (D). La región tegmental ventral aislado a partir de diapositivas-silano prep utilizando sólo el láser IR también se muestra unido a una tapa de Macro (FK). Tenga en cuenta que se necesita más de un intento de recopilar la mayor parte del tejido de esta región (comparación G y J). Barra de escala = 500 micras.pload / 52336 / 52336fig8large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 9. calidad del ARN. Electroferogramas representativos y gel de imágenes asociadas de ARN comercialmente disponible todo el cerebro (A) y el ARN aislado a partir de secciones después de la fijación acetona y LCM (B) o rápida fluorescente inmunohistoquímica de tirosina hidroxilasa y LCM (C). Aunque la calidad del RNA se redujo en las secciones procesadas para inmunohistoquímica, en comparación con ARN de todo el cerebro, los electroferogramas demuestran RNA su mayoría intacta en virtud de la presencia de los picos de rRNA S18 y S28. Total concentración de ARN del cerebro era 6.487 pg / l con una RIN de 8,2. Concentración de ARN tejido fijado acetona se 5.036 pg / l con una RIN de 2,6. ARN obtenido después de inmunohistoquímica h ad una concentración de 4.474 pg / ly RIN no estaba disponible. Figura 10. Cantidad de ARN. Para determinar la cantidad de ARN en las neuronas obtenidos con LCM, una curva estándar de concentraciones de ARN se produjo usando una fluorospectrometer y Q-PCR. Para las mediciones fluorospectrometer (A), la gran gráfico muestra la gama más alta de cantidades de ARN y el pequeño gráfico muestra la sensibilidad de este ensayo a 10 pg / l. Las concentraciones de ARN obtenidos a partir de 50, 100 y 200 neuronas de dopamina fue 17,3, 24,8 y 50,9 pg / l, respectivamente. El uso de Q-PCR para medir las cantidades de ARN (B), las concentraciones de ARN obtenido de 50, 100 y 200 neuronas de dopamina fue 3,55, 6,82 y 20,58 pg / l, respectivamente. en / ftp_upload / 52336 / 52336fig11highres.jpg "/> Figura 11. Concentración de genes específicos de neuronas de dopamina con el aislamiento de las neuronas de dopamina individuales. La diferencia en C t (? C t) entre los genes de las neuronas de dopamina específicos (Nurr1, la tirosina hidroxilasa, y transportador de dopamina) y β-actina en muestras de las neuronas de dopamina en el área tegmental ventral aislado con LCM en comparación con la expresión en las disecciones de toda la región tegmental ventral se muestran. Dado que los valores t reducción de C se generan con una mayor concentración del gen de interés, una disminución en el? C t indica un incremento en la expresión de los genes de las neuronas de dopamina en relación con β-actina como otras células (neuronas no dopaminérgicas y células gliales) se ser recogidos en las muestras de área tegmental ventral que expresan β-actina, pero no expresan genes neuronas de dopamina.

Discussion

LCM es una técnica poderosa para la disección de poblaciones discretas de células o regiones de tejido a partir de secciones de tejido sobre un portaobjetos de microscopio y el posterior aislamiento de ARN, microARN, el ADN y las proteínas. El uso de LCM en combinación con análisis utilizando tecnologías de alto rendimiento como los microarrays, junto secuenciación de ARN generación, análisis epigenéticos del ADN y la proteómica se está volviendo más y más común como la sensibilidad de estas técnicas de mejora y la cantidad de material de partida necesario se reduce 8-12. Con LCM, se consigue una mejor resolución anatómica para una muestra, y la comprensión de las medidas de aguas abajo de estas muestras es mucho mayor. Una advertencia con LCM es que proporciona una muestra concentrada de las células de interés, pero no necesariamente una población pura de células. Los límites de la precisión significan que habrá algo de contaminación a partir de tejido adyacente. Sin embargo, esta técnica hace concentrar las células de interéspara minimizar los efectos asociados con las células y el tejido circundante y maximizar los efectos experimentales sobre las células de interés.

Directa frente indirecta inmunohistoquímica

Desde LCM está actualmente utiliza principalmente para el aislamiento y la medición de ARN, manteniendo ARN intacto es un criterio muy importante. El mantenimiento de la integridad del ARN es la razón principal detrás del uso de inmunohistoquímica indirecta para guiar la disección del tejido que elimina la necesidad de teñir el tejido directamente que puede degradar el ARN (Figura 10). Cuando la pregunta experimental, sin embargo, requiere el aislamiento de una población específica de células, tales como las neuronas de dopamina, se requiere inmunohistoquímica de fluorescencia directa. El uso de un protocolo rápido etiquetado inmunohistoquímica puede minimizar la degradación del ARN durante el procedimiento. Los tiempos de incubación cortos son debido a la utilización de altas concentraciones de anticuerpos anti primaria y secundariacuerpos, concentraciones que son alrededor de 10-20 veces superiores a lo necesario para inmunohistoquímica convencional con un 2 h de incubación. Si sin embargo, se requieren tiempos de incubación más largos, Brown y Smith utilizaron tampones elevadas de sal para inhibir la degradación del ARN y ARN obtener una buena calidad con tiempos de incubación largos (hasta 20 h) 13. Este enfoque también puede ser usado si hay tiempo sustancial requerida entre el etiquetado del tejido y obtener acceso a un sistema LCM.

Elección de diapositivas – membrana PEN, Silano-prep y portaobjetos de vidrio sin recubrimiento

El uso de portaobjetos de vidrio no recubiertos para LCM se han notificado 14. En nuestro laboratorio, diapositivas-silano prep se han encontrado para ser una elección óptima, ya que este revestimiento se adhiere suficientemente el tejido a la diapositiva para inmunohistoquímica sin pérdida de tejido, pero todavía permite para la fijación del tejido a las tapas de LCM y la eliminación de la diapositiva . Portaobjetos de vidrio no recubiertos tienenmostró una cierta pérdida de tejido con el procedimiento de inmunohistoquímica. Si se utiliza inmunohistoquímica indirecta, sin embargo, la retención de tejido se convierte en un problema menor. Con deshidratación adecuado, las células que capturan o tejido fuera de diapositivas silano preparación no ha sido un problema. Cada uno de los diversos enfoques de las neuronas de aislamiento o regiones del cerebro que se describen en este trabajo tiene sus ventajas y desventajas. Para el aislamiento de las neuronas de dopamina individuales, el uso de diapositivas-silano de preparación tiene la ventaja de una mejor óptica y es menos caro que los portaobjetos de membrana PEN. La desventaja es que las células veces captura puede ser difícil si hay deshidratación insuficiente (ver más abajo) y parte del tejido se puede dejar en la diapositiva. La ventaja de las membranas diapositivas PEN es que el uso de la combinación de láser y láser UV IR asegura que se recogerán las neuronas de dopamina. Si no se recoge células de una pluma se desliza membrana casi nunca ocurre, ya que es menos dependiente de la deshidratación que los portaobjetos de vidrio. Una ventaja adicional es que el láser UV se puede utilizar para aproximar más de cerca la forma de las neuronas de interés, en comparación con un círculo para la captura de neuronas fuera de portaobjetos de vidrio con el láser de IR. Para el aislamiento de las regiones de tejido, las diapositivas de membrana PEN son muy superiores y justifican el costo adicional. Este enfoque da como resultado la eliminación completa de todo el tejido cortado en la membrana, es mucho más rápido que la captura de una gran área de tejido utilizando el láser IR solos y secciones de tejidos más gruesos pueden ser recogidos. Usando sólo el láser IR requiere que la membrana de la tapa LCM se derrita por completo en toda la superficie del tejido. Además, colección incompleta del tejido es típico y generalmente requiere múltiples intentos. Aunque esto lleva más tiempo que el aislamiento de tejido de la membrana de diapositivas PEN, si el tejido disponible es ya en un portaobjetos de vidrio o un láser UV no está disponible, esta es una opción viable ya que la mayoría de los tejidos pueden ser recogidos (Figura 8J).

ove_content "> Los pasos críticos

Las incubaciones 100% de etanol son uno de los pasos más importantes. Con el fin de recoger las células a partir de diapositivas Silano-prep se requiere deshidratación completa del tejido. Por lo tanto, el agua no se elimina, el cual está asociado principalmente con la incubación de etanol 100%, tendrá un impacto en la capacidad de recoger las células de los portaobjetos. A fin de abordar este problema, con frecuencia cambiar las soluciones de etanol 100% como la absorción de agua del aire o la transferencia de las etapas de lavado anteriores pueden afectar a la deshidratación. Además, los tamices moleculares se utilizan para absorber cualquier contaminación del agua. El sistema LCM ideal sería que se encuentra en una pequeña habitación con un deshumidificador para mantener las condiciones de humedad baja.

Buenas secciones de criostato son críticos para LCM adecuada. Secciones necesitan ser plana con pliegues en el tejido minimizado. Se pliega en el tejido aumentará la distancia entre la tapa LCM y evitar que entre en contacto con tél tejido. Entonces se convierte en difícil de fundir suficientemente el cabezal de la membrana sobre el tejido. Para portaobjetos de vidrio, por lo general el espesor de corte debe estar entre 6 y 12 micras. Secciones más gruesas pueden ser capturados con las diapositivas de membrana PEN.

LCM ofrece una capacidad técnica para hacer disecciones muy precisas de tejidos y células de portaobjetos de microscopio. Esto aumenta drásticamente la resolución de un análisis adicional en comparación con la disección macroscópica de piezas de tejido. Aunque, LCM puede llevar mucho tiempo y mano de obra, que no requiere una amplia formación o experiencia y, cuando se combina con otras tecnologías de alto rendimiento, puede mejorar enormemente la comprensión de un proceso biológico cuando se usan células diferenciadas o regiones anatómicas.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was funded by the National Institute of Mental Health (1R15MH084209 – 01A1), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (R21NS058375-01A2) and the National Science Foundation (DBI0723080 07070646).

Materials

Name of the Material/Equipment Company Catalog Numer  Comments
Veritas Laser Capture Microdissection System Life Technologies, Grand Island, NY Newer model is now sold
CapSure Macro LCM Caps Life Technologies, Grand Island, NY LCM0211
CapSure HS LCM Caps Life Technologies, Grand Island, NY LCM0213
PEN Membrane slides Life Technologies, Grand Island, NY s4651
Silane prep-slides Sigma-Aldrich, St. Louis, MO S4651
95% Ethanol-RNase Free Sigma-Aldrich, St. Louis, MO E7148
100% Ethanol-RNase Free Sigma-Aldrich, St. Louis, MO E7023
Rnase Free Triton Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T8787
Molecular Sieve EDM Millipore, Billerica, MA MX1583D
Anti-Tyrosine hydroxyase antibody EDM Millipore, Billerica, MA Ab152
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG Life Technologies, Grand Island, NY A-11008
2100 Bioanalyzer Agilent Technologies, Santa Clara, CA G2939AA
Stratagene MX 3005P Agilent Technologies, Santa Clara, CA 401513
Nanodrop 3300 fluorospectrometer Thermo Scientific
Quant-iT RiboGreen Life Technologies, Grand Island, NY R11490
RNaseZap Life Technologies, Grand Island, NY AM9780
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Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Kummari, E., Guo-Ross, S. X., Eells, J. B. Laser Capture Microdissection – A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area. J. Vis. Exp. (96), e52336, doi:10.3791/52336 (2015).
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