레이저 캡처 이외에 Microdissection - 개별 도파민 신경 세포의 분리 및 전체 복부 피개 영역의 데모

참고 : 마우스의 뇌 조직이 실험 동물의 관리 및 사용을위한 건강 가이드의 국립 연구소에 따라 사용하고, 연구 프로토콜 미시시피 주립 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 슬라이드 및 조직 1. 준비 실란 준비 슬라이드 또는 폴리에틸렌 napthalate (PEN) 막 유리 슬라이드를 사용합니다. RNA의 분리를 위해,의 RNase 염액 딥 슬라이드는, 다음의 RNA 분해 효소가없는 물을 3 회 세척을 30 분 동안의 RNase가없는 에탄올 및 진공 건조의 일련의 경사 탈수. 저온 유지 장치를 사용하여 10 μm의 두께로 조직 절편을 잘라 준비의 RNase 무료 슬라이드에 탑재합니다. RNA의 품질을 유지하기 위해 단면 동안 냉동 섹션을 유지합니다. 참고 : 조직이 약 4mm 떨어진 슬라이드의 가장자리에 너무 가까이 조직을 제거 할 수 없습니다 LCM과 슬라이드의 가장자리에서 있는지 확인하십시오. 순으로 하였다r은 PEN 막 슬라이드로부터 조직을 제거 조직 왼쪽, 위쪽과 아래쪽에서 4mm 슬라이드에 부착되지 않은 멤브레인의 치수가 슬라이드의 오른쪽에서 7mm이다되도록. 실란 준비 슬라이드 또는 PEN 막 슬라이드 중 하나에 직접 면역 조직 화학, 섹션 조직을 사용하여 개별 세포 집단의 분리하십시오. 간접 면역 유도 기술을 사용하여 조직의 영역의 분리를 들어, LCM에 사용되는 PEN 막 슬라이드 및 / 또는 실란 준비 슬라이드 중 하나에 대한 면역 조직 화학 염색 및 대체 섹션에 대한 실란 준비 슬라이드에 섹션 중 하나 세트를 탑재합니다. 레이저 캡처 2. 조직 준비 – 면역 반응성 세포의 직접 레이저 캡처에 대한 신속한 티로신 하이드 록 면역 조직 화학 소수성 펜으로 조직 개요 건조 할 수 있습니다. 아세톤 – 메탄올 조직을 고정 (1 : 1) 10 분 동안 -20 ℃에서 용액. 참고 : 오우R 경험은 아세톤, 메탄올 고정 혼자 아세톤, 메탄올보다 훨씬 더 일관성 면역 조직 화학 염색 결과 것으로 나타났습니다. 인산 린스 슬라이드 1 % 트리톤 (의 RNase 무료)와 식염수 (PBS)를 버퍼. 400 U / ㎖ RNasin 100 : 티로신 수산화 항체와 1 % 트리톤과 100 ~ 200 μl의 PBS와 커버 섹션 1을 희석. 5 ~ 10 분 동안 품어. 짧게 두번 PBS에 세척하여 PBS-1 % 트리톤. 100 PBS-1 % 트리톤 400 U / ㎖ RNasin 50 NG / ㎖ DAPI와 : 1 희석 알렉사 플 루어 488로 표지 염소 항 – 토끼 IgG에의 100 ~ 200 μL로 조직을 커버. 5 분 동안 품어. PBS로 2 회 씻어 것은 다음의 RNase 무료 에탄올의 등급 시리즈 30의 탈수 (75 % -75 % -95 % -95 % -100 % -100 %). 다음 1 분 5 분 동안 크실렌의 두 세척에 품어. 직전이 LCM에 사용하는 공기 건조되도록 크실렌에서 슬라이드를 제거합니다. 레이저 캡처 3. 조직 준비 – 티로신면역 반응성 지역의 간접 레이저 캡처를위한 수산화 면역 조직 화학 섹션에 인접한 섹션이 처리 한 슬라이드 실란 – 준비 및 / 또는 면역 조직 화학 염색에 대한 PEN 막 슬라이드에 장착. 참고 : 여기에 사용 된 절차 이전에 5를보고 유사하다. 시범 이미지의 경우, 디아 미노 벤지딘 (DAB) 크로마 반응 관심 티로신 수산화 뉴런를 시각화하는데 사용되었다. LCM에 사용되는 슬라이드를 들어, 4 ° C에서 100 % 아세톤 5 분 동안 고정한다. 의 RNase 무료 에탄올의 등급 시리즈에서 조직을 탈수 (75 % -75 % -95 % -95 % -100 % -100 %)을 각각 1 분합니다. 다음 1 분 5 분 동안 크실렌의 두 세척에 품어. 직전이 LCM에 사용하는 공기 건조되도록 크실렌에서 슬라이드를 제거합니다. 4. 레이저 캡처 이외에 Microdissection 시스템 사용 참고 : LCM 응용 프로그램은 10 도구 바을 제어하는​​ 2 창문이미세 절제 절차. 도구 모음 : 1. 현미경, 2. 캡처 레이저, 3 절단 레이저, 4. 연구, 5. 탐색, 6. 재료, 7. 캡처 그룹, 8 이외에 Microdissection, 9 글꼴, 10 주석. 윈도우 : 1. 라이브 비디오 및 2 도로지도. LCM 시스템 소프트웨어의 재료 도구 모음에서 "문을 열고"탭을 선택하여 문을 엽니 다. 세 가지 사용 가능한 슬롯에로드 슬라이드. 이 데모를 들어, 티로신 수산화 효소 면역 조직 화학 염색과 부하 하나의 슬라이드는 DAB, 하나 실란 준비 슬라이드 한 PEN 막 슬라이드 빠른 형광 티로신 수산화 효소 면역 표지 각각 시각. 전형적인 실험에서, 직접 레이저 캡처를위한 형광 티로신 수산화 효소로 표지 티로신 DAB를 사용하여 수산화 또는 슬라이드 표지 참조 슬라이드 중 하나 레이블이없는 아세톤 고정 섹션을 사용합니다. 사용 가능한 슬롯에 LCM 캡을로드합니다. 참고 : 매크로 및 HS LCM 모자가 사용할 수 있습니다. LCM 캡의 형태는 데 사용하는세포 나 조직의 양의 수에 따라 좌우된다 수집한다. 매크로 슬라이드 HS 캡 수백를 수집 할 수 있습니다 동안 수천 개의 셀을 수집 나열되어 있습니다. 매크로 슬라이드는 더 조직 수집을 허용하지만, 용해 버퍼의 50 μl를 필요로한다. 어댑터와 함께 사용할 경우 HS 캡, RNA의 큰 비례 ​​복구 할 수 있습니다 용해 버퍼의 10 μl를 필요로한다. 문을 닫습니다. 전체 슬라이드의 작업 뷰를 제공하는 도로지도 창을 활성화 할 수있는 슬라이드를로드,이 (그림 3) 관심의 영역을 선택할 수 있습니다. 관심 영역으로 이동 라이브 비디오 창에 도로지도를 볼 수 있습니다. 재료 도구 모음에서 슬라이드 슬롯 위의 상자를 선택하여 PEN 막 슬라이드를 식별합니다. 캡 속성을 제공하려면, 오른쪽 재료 도구 막대에서 모자를 클릭하고 "캡 공급 속성"을 선택합니다. 캡의 위치를​​ 나타내는 상자를 확인하고 어느 엄마 선택CRO 또는 HS 모자. 형광 램프를 켜고 형광 램프가 예열 ​​수 있도록 현미경 도구 모음에서 "형광"탭을 선택합니다. 각각 알렉스 형석 488 및 DAPI를 시각화하기 위해 블루와 UV 필터를 사용합니다. 형광 표지 된 세포를보기 위해 이미지의 감도를 높이기 위해 "카메라 설정"탭을 사용하십시오. 재료 도구 모음에서 마우스 오른쪽 캡을 클릭하고 원하는 슬라이드로 이동합니다. 라이브 비디오 창에 표시되는 영역을 선택할 수있는 도로지도에 위치를 더블 클릭합니다. 도로지도 영역 (더블 마우스 왼쪽 버튼을 클릭) 다음은 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 선택을 선택하여 슬라이드에 주위 뚜껑을 이동 "중앙 지역에 배치 캡을." IR 캡처 레이저를 사용하기 전에 목표로 강도를 조절합니다. 멀리 조직에서 슬라이드의 영역에서 뚜껑을 놓습니다. 캡처 레이저 도구 모음에서 "사용"을 선택합니다. 전원 (3-100 MW), 펄스를 조정 (100-1000000 μ; 초) 레이저의 # 조회수. 캡 조직없이 슬라이드의 일부 위에있을 때 IR 레이저를 발사 레이저 충분히 LCM 캡 막 녹아 있는지 확인합니다. 참고 : 캡에 고분자막 녹는이라고 습윤에 접촉 유리 슬라이드 있도록. 어두운 반지 명확 링 (충분하고 부족 용해의 예를 그림 4 참조)의 중심에 슬라이드 융합으로 충분한 습윤 볼 수 있습니다. 습윤성이 충분하지 않으면이 달성 될 때까지, 다시 전력 및 펄스 및 테스트 화재를 조정. 또한, 레이저의 다수의 화재가 또한 사용될 수있다. IR 레이저 강도를 조절하면 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 레이저를 목표로 "캡처 레이저가 여기에있다"를 선택합니다. 참고 :이 단계는 IR 캡처 레이저가 조직을 대상으로 컴퓨터를 알려줍니다. 레이저 조준이 단계는 매우 중요하며, 캡이 이동 될 때마다 반복 될 필요 또는 목적은 변경된다. </oL> 실란 준비 슬라이드 오프 개별 도파민 뉴런의 5. 레이저 캡처 이외에 Microdissection 세포를 캡처하는 관심 영역으로 이동합니다. 참고 : 분리 도파민 신경 세포의 예는 여기에 표시됩니다. 실란 준비 슬라이드 오프 개별 셀을 캡처하려면, 이외에 Microdissection 도구 모음에서 다음 "단일 지점"아이콘 "LCM"탭을 선택합니다. 현미경 도구 모음에서 해당 필터를 선택하는 형광 필터 탭이있는 형광 밝은 필드 사이를 전환 할 "셔터"탭을 사용하여 배율을 변경하려면 목표 탭을 사용합니다. 관심 셀 라이브 비디오 윈도우에 표시되면, 셀의 대략적인 크기를 관심 세포를 표시하는 데 사용 스폿 크기를 조정한다. 다음 반대쪽을 클릭하여 다음에 스테인드 셀의 한면을 클릭 캡처 레이저 도구 모음에서 스팟 탭을 클릭하여이 작업을 수행합니다. 참고 :이를 계산현장의 직경은 값을 표시합니다. "단일 지점"아이콘을 선택한 상태에서 그들을 클릭하여 관심의 세포를 표시합니다. 각 셀에 자리 마커를 배치하는이 작업을 수행합니다. 여기에, 블루 필터와 10 배의 목적은 도파민 신경 세포를 시각화하는 데 사용됩니다. 다시 테스트 및 단계 4.9과 4.10에 설명 된대로 그 아래에는 조직이없는 경우 캡에 IR 레이저를 목표로하고 있습니다. 자동으로 선택되는 모든 표시 셀을 발광하는 이외에 Microdissection 도구 모음 및 IR 레이저에 탭 – 세포가 표시되면, "컷 캡처 이동"을 선택합니다. 필요한 경우 또한, 관심의 포인트 (그림 5D)에서 수동으로 IR 레이저를 발사. 세포가 LCM 캡에 캡처 된 경우 확인하기 위해 멀리 섹션에서 슬라이드의 개방 영역 위에 캡을 이동합니다. 관심의 세포가 슬라이드 (그림 5B, E)에서 제거되고 LCM 캡 (그림 5C, F)에 제대로 연결되어 있는지 확인하십시오. 문서 일현미경 도구 모음에서 "캡처 이미지"탭을 클릭하여 과정이다. 조직을 수집이 완료되면, 캡을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 캡을 제거하고 "로 이동"을 선택 "언로드." PEN 막 슬라이드 오프 개별 도파민 뉴런의 6 레이저 캡처 IR 및 UV 레이저를 모두 사용하여 PEN 막 슬라이드 오프 개별 셀을 캡처하려면 "잘라 캡처"이외에 Microdissection 도구 모음에서 탭을 선택합니다. 관심의 세포를 표시하는 "단일 지점"탭을 선택합니다. 각 셀의 윤곽을 "컷 라인"탭을 사용합니다. 단계 4.9과 4.10에 설명 된대로 IR 레이저를 테스트해야하고 생각 잘라 필요한 최소한의 강도 PEN 막 및 조직 결정하기 위해 UV 레이저를 테스트 (그림 4, 5) 이외에 Microdissection 도구 모음에 "캡처 및 절단"탭을 선택합니다. 이 기술을 사용하여 개별 세포를 수집 할 때,이 될그들은 LCM 캡에 부착되기 전에 잘라 경우 먼저이 작은 조각으로 UV 레이저 뒤에 IR 레이저를 발사 할 수 있는지가 손실 될 수 있습니다. 주 :이 프로세스는 또한 관심의 지점에서 IR 레이저를 발사하여 수동으로 수행 될 수 있고, 세포가 개별적 UV 레이저로 설명했다. 세포를 제거하고 캡 (그림 6)에 부착되었는지 확인하는 단계 5.7에서 상술 한 바와 같이 관심있는 세포를 수집 한 후, LCM 캡을 이동합니다. 조직을 수집이 완료되면, 오른쪽 캡을 클릭하고 선택하여 캡을 제거하고 "로 이동" "언로드." 7. 실란 준비 슬라이드에서 복부 피개 영역 캡처 관심 영역을 식별하기 위해 면역 조직 화학 염색을 위해 처리 슬라이드를 사용합니다. 참고 : 복부 피개 영역이 격리 된이 데모 (그림 7A)를 참조하십시오. LCM 뚜껑을로드하고 단계에서와 같이 레이저를 테스트4.9 및 4.10에요. 주 : 일반적으로, 매크로 LCM 캡이 사용되지만, HS 캡도 (도 8 참조)를 사용할 수있다. 이외에 Microdissection 도구 모음에서 "LCM"탭을 선택, 실란 준비 슬라이드에서 조직의 영역 (즉, 복부 피개 영역)을 분리하려면 다음 "다각형 외부"탭을 선택합니다. 라이브 비디오 창에서 관심 영역을 설명합니다. 수집을위한 영역의 크기의 따라, 낮은 배율 (배 목표)에서 관심 영역을 설명합니다. 컬렉션을 위해, 그러나, 장비는 10 배 목표는 그래서 조정하고 촬영에 10 배 목표 아래 IR 레이저를 이전을 목표로 사용합니다. 이외에 Microdissection 도구 모음에서 – "캡처 및 절단 이동"탭을 선택합니다. 참고 : 컴퓨터가 자동으로 전체 선택 영역 (그림 7 층, I)를 통해 IR 레이저를 발사합니다. LCM 막을 영역에 걸쳐 충분히 용융되어 있지 않은 경우, 레이저는 사람을 소성 될 수있다단계적 또는 전체 과정을 반복. 조직이 수집 얼마나 잘 결정하기 위해 조직의 오프 LCM 캡을 이동합니다. 참고 :이 방법을 사용하여 하나의 패스는 일반적으로 슬라이드 (Figure7G 참조)에 뒤 일부 조직을 떠난다. 이 경우, 상기 선택을 반복하고 상기 단계를 캡처. 이 단계를 반복하면 (도 7J) 수집 된 조직의 양을 증가시킬 수있다. 조직을 수집이 완료되면, 오른쪽 캡을 클릭하고 선택하여 캡을 언로드하고 "로 이동" "언로드." 8. PEN 막 슬라이드에서 복부 피개 영역 캡처 상기와 PEN 막 슬라이드에 조직에서 관심 영역을 선택하는 가이드로 면역 조직 화학 염색을 위해 처리 슬라이드를 사용합니다. 이외에 Microdissection 도구 모음에서 "잘라 캡처"탭을 선택합니다. "컷 라인"탭을 선택하고 immunohistoche를 사용하여 관심 영역 개요Mistry의 지침으로 슬라이드를 표시. 참고 :이 프로그램은 자동으로 뚜껑에 조직을 첨부 할 IR 레이저에 대한 지점을 추가합니다. 더 나은 상한에 조직을 확보하기 위해 추가로 지점을 추가하려면 "단일 지점"탭을 사용합니다. 10X 목적, 시험 화재에서 4.9과 4.10에 설명 된대로 IR 및 UV 레이저를 목표로하고 있습니다. UV 레이저 슬라이드 컷이 컴퓨터 화면상의 위치에 대응하는 것을 막을 수 있다는 침투 테스트한다. 막과 조직을 잘라 단지 충분하지만, 조직 (그림 5)에 손상을주지 않는 UV 레이저 강도를 사용합니다. 이외에 Microdissection 도구 모음에서 – "캡처 및 절단 이동"탭을 선택합니다. 참고 : 컴퓨터가 자동으로 다음 뚜껑에 부착 슬라이드 PEN 막 조직 (그림 7C)를 절단하는 UV 레이저를 발사 조직 내의 모든 표시된 지점에서 IR 레이저를 발사합니다. 추가 IR 용융 점이 충분히 아시고을 첨부 할 필요가있다또한 수동으로 추가 할 수있는 LCM 캡에 소송을 제기. 조직 섹션 (그림 7C)에서 제거하고 캡 (그림 7C)에 부착 된 경우 결정하기 위해 조직의 오프 LCM 캡을 이동합니다. 조직을 수집이 완료되면, 오른쪽 캡을 클릭하고 "로 이동"을 선택, 캡을 제거하는 방법 "을 언로드." RNA 9. 분리 캡처 된 세포 또는 조직으로부터 RNA를 수집하기 위해, 37 ° C에서 30 분 동안 RNA 용해 완충액 LCM 캡 막을 배양한다. 주 : HS 캡용, 어댑터 뚜껑에 용해 완충액 10 μL의 사용을 허용하고, 0.5 ml의 마이크로 원심 분리 튜브에 부착이 가능하다. 매크로 캡은 용해 완충 용액 50 μL을 필요로하고, 0.5 ml의 마이크로 원심 분리 튜브에 직접 부착. 배양 후, 0.5 ml의 마이크로 원심 분리 튜브로 다운 용해 버퍼 스핀. O 모든 세포의 완전한 용해를 보장하기연구 조직, 용해 버퍼의 캡과 장소의 LCM 캡 막 떼어. RNA 무결성을 테스트하기 위해 사용 RNA는 LCM은 RNA의 무결성을 측정 한 후 슬라이드에 남아있는 조직에서 분리. 참고 : LCM 얻어진 제한된 샘플 RNA하기 위해서는 LCM 절연 RNA에서 RNA의 무결성을 테스트하는 통상적 실용적이지 인해 그러나 나머지 조직으로부터 RNA 인해 동안 고정, 면역 조직 화학 및 시간에 임의 RNA 분해의 좋은 지표를 제공한다 LCM 절차.