レーザーキャプチャーマイクロダイセクション - 個々のドーパミンニューロンの単離と全体の腹側被蓋領域の実証

注：マウスの​​脳組織は実験動物の管理と使用に関する健康ガイドの国立研究所に従って使用して、研究プロトコルはミシシッピ州立大学の施設内動物管理使用委員会によって承認された。 スライドと組織の作製シランプレップスライドまたはポリエチレンナフタレート（PEN）膜ガラススライドのいずれかを使用してください。 RNA単離のために、RNアーゼ除染液中のディップスライドを、RNアーゼを含まない水で3回洗浄し、30分間、RNaseフリーエタノールおよび真空乾燥の段階的な一連の脱水する。 クライオスタットを用いて、10μmの厚さで組織切片をカットし、準備されたRNaseを含まないスライドにマウントします。 RNAの質を維持するために、切片中に凍結切片にしてください。 注：組織は、約4ミリメートル離れてスライドの端に近すぎる組織を除去することはできませんLCMとしてスライドの端からであることを確認してください。オードでrは、PEN膜スライドから組織を除去する組織は、左、頂部及び底部から4mmでスライドに取り付けられていない膜の寸法は、スライドの右側から7mmであることを確実にする。 シランプレップスライドまたはPEN膜、スライドのいずれかの上に直接、免疫組織化学、セクション組織を使用して、個々の細胞集団を単離するため。間接的な免疫組織化学技術を用いて導かれた組織領域の単離のために、LCMのために使用されるPEN膜、スライドおよび/またはシランプレップスライドのいずれかで免疫組織化学および代替セクションのシランプレップスライド上の切片の一組のマウント。 レーザーキャプチャー2.組織標本 – 免疫反応性細胞の直接レーザーキャプチャーの迅速チロシンヒドロキシラーゼ免疫組織化学疎水性のペンで組織をアウトラインと乾燥させます。 アセトン – メタノールで組織を修正しました。（1：1）10分間、-20℃での溶液。 注：王rは経験はアセトン – メタノール固定単独アセトンまたはメタノールよりもはるかに一貫性の免疫組織化学をもたらしたことを示している。 リン酸リンススライドを、1％トリトン（RNaseを含まない）で緩衝食塩水（PBS）。 400 U / mlののRNasinで100：チロシンヒドロキシラーゼ抗体と1％のトリトンと100〜200μlのPBSでカバーセクション1に希釈。 5〜10分間インキュベートする。 二回PBSで簡単にすすぎ、PBS-1％トリトン。 100 PBS-1％トリトン400 U / mlでのRNasinおよび50ng / mlのDAPI：1希釈したアレクサフルオロ488で標識したヤギ抗ウサギIgGを100〜200μlの組織をカバーする。 5分間インキュベートする。 その後RNaseを含まないエタノールの段階的な一連の（75％-75％-95％-95％-100％-100％）に30秒を脱水PBS中で2回洗浄します。 その後1分5分間キシレンの2回の洗浄でインキュベートする。 LCMのために使用する前にすぐにキシレンからスライドを取り出し、空気乾燥させ。 レーザーキャプチャー3.組織標本 – チロシン免疫反応領域の間接レーザーキャプチャー用の水酸化酵素免疫組織化学セクションに隣接するセクションとのプロセスつのスライドは、シランプレップおよび/または免疫組織化学のためのPEN膜スライド上にマウント。 注：ここで使用される手順は、以前に報告された5と同様である。デモ画像では、ジアミノベンジジン（DAB）色素原反応は、関心のあるチロシンヒドロキシラーゼニューロンを可視化した。 LCMのために使用されるスライドのために、4℃での100％アセトン中で5分間固定する。 1分ごとに、RNアーゼフリーのエタノール（75％-75％-95％-95％-100％-100％）の段階的なシリーズの組織を脱水。 その後1分5分間キシレンの2回の洗浄でインキュベートする。 LCMのために使用する前にすぐにキシレンからスライドを取り出し、空気乾燥させ。 4.レーザーキャプチャーマイクロダイセクションシステムの使用注：LCMアプリケーションプログラムが制御する10のツールバーと2窓が顕微解剖手続き。ツールバー：1.顕微鏡、2。キャプチャレーザー、3カッティングレーザー、4。研究、5。ナビゲーション、6。マテリアル、7。キャプチャグループ、8顕微解剖、9。フォント、10注釈。 Windowsの場合：1.ライブビデオと2ロードマップ。 LCMシステムソフトウェアにおける材料·ツール·バーの「Openドア」タブを選択することで、ドアを開きます。 負荷が利用可能な3つのスロットにスライドします。このデモでは、チロシンヒドロキシラーゼ免疫組織化学と負荷つのスライドは、DAB、1シランプレップスライドと1 PEN膜スライド急速な蛍光チロシ​​ン水酸化酵素免疫組織化学のために標識された各で可視化した。典型的な実験では、直接レーザー捕捉のための蛍光チロシ​​ンヒドロキシラーゼで標識されたDABやスライドを使用してチロシンヒドロキシラーゼのための標識参照スライドで標識されていないアセトン固定切片のいずれかを使用する。 利用可能なスロットにLCMキャップをロードします。 注：マクロとHS LCMキャップが使用できます。ドを使用するLCMキャップのタイプ収集される細胞または組織の量の数を保留します。マクロスライドをHSキャップは数百を収集することができますしながら、数千までのセルを収集するために記載されています。マクロスライドは、より多くの組織採取のために可能にするが、溶解緩衝液50μlを必要とする。アダプターで使用されるHSキャップは、RNAの大きな比例回復を可能にし、溶解緩衝液のみの10μlのを必要とします。 ドアを閉じます。 スライド全体の作業ビューを提供するロードマップウィンドウをアクティブにするスライドをロードして、これは関心領域（ 図3）の選択を可能にする。関心のある領域に移動しライブビデオウィンドウにロードマップを表示します。 マテリアル·ツール·バーでは、スライドスロット上のボックスをチェックすることにより、PEN膜スライドを特定する。キャップのプロパティを供給するために、右のマテリアルツールバーにキャップをクリックして、「キャップ供給のプロパティ」を選択します。キャップの位置を示すボックスをチェックして、馬のいずれかを選択CROまたはHSのキャップ。 蛍光灯をオンにし、蛍光灯は、ウォームアップすることを可能にするために顕微鏡のツールバーに「蛍光」タブを選択します。それぞれ、アレックスフルーア488およびDAPIを可視化するために、ブルーとUVフィルターを使用してください。蛍光標識した細胞を見るために、画像の感度を高めるために「カメラの調整」タブを使用します。 マテリアル·ツール·バーでは、右キャップをクリックして、目的のスライドに移動します。ライブビデオウィンドウに表示される領域を選択するロードマップで場所をダブルクリックします。ロードマップ（左ダブルクリック）し、右クリックして選択上の領域を選択することで、スライド上の周りにキャップを移動する「中央領域で起こるキャップ。」 IRキャプチャレーザーを使用する前に、目的と強さのためにそれを調整します。離れて組織からスライドの領域にキャップを置きます。キャプチャレーザーツールバーで、「有効にする」を選択し電源（3-100 mW）と、パルスを調整して（100から1000000μ;秒）とレーザーの＃ヒット。キャップが組織することなく、スライドの一部の上にあるときにIRレーザーを発射し、レーザーは十分にLCMキャップ膜を融解するかどうかを確認してください。 注：キャップ上に高分子膜を溶融され、この呼ばれる湿潤に接触するガラススライドするように。十分な湿潤が（十分と溶融不足の例については図4を参照してください）明確なリングの中心とスライドに融合したダークリングとして表示されます。濡れが十分でない場合、これが達成されるまで、再度電源とパルス、およびテスト火災を調整する。また、レーザの複数の火災を使用することもできる。 IRレーザーの強度を調整すると、右クリックして、レーザーを目的とする「キャプチャレーザーがここにあり」を選択します。 注：この手順がIRキャプチャレーザーが組織を目指しているコンピュータに指示します。レーザー照準のこのステップは重要であり、キャップを移動させるか、目的が変更されるたびに繰り返す必要がある。 </oL> シランプレップスライドのオフ個々のドーパミンニューロンの5レーザーキャプチャーマイクロダイセクション細胞を捕捉するために関心領域に移動する。 注：隔離ドーパミンニューロンの例がここに示されています。 シランプレップスライドのオフ個々の細胞を捕捉するために、マイクロダイセクションのツールバーにし、 "一点"アイコン "LCM」タブを選択します。 顕微鏡のツールバーでは、適切なフィルタを選択し、倍率を変更するには、目的のタブを使用するために、蛍光フィルターのタブで蛍光と明視野を切り替える「シャッター」タブを使用します。目的の細胞がライブビデオウィンドウに表示されたら、細胞のおおよそのサイズに目的の細胞をマークするために使用されるスポットサイズを調整します。その後反対側をクリックすることで、その後に染色された細胞の片側をクリックするキャプチャレーザー·ツール·バー上のスポット]タブをクリックすることでこれを行います。 注：これは計算しスポット径と値を表示します。 「シングルポイント」アイコンが選択されている間、それらをクリックすることで目的の細胞をマークします。各セルにスポットマーカーを配置するためにこれを行います。ここで、青色フィルタおよび10Xの対物レンズは、ドーパミンニューロンを可視化するために使用される。ステップ4.9と4.10で説明したように、その下にない組織が存在しないキャップ上のIRレーザーを再テストし、目指しています。 自動的に選択されたすべてのマークされたセルを発射します顕微解剖ツールバーとIRレーザー上のタブ – セルがマークされたら、「カットとキャプチャを行く "を選択します。さらに、必要に応じて、興味（ 図5D）の任意の時点で手動でIRレーザーを発射する。 細胞はLCMキャップ上に捕捉されたかどうかをチェックするために離れてセクションから、スライドのオープン領域上にキャップを移動します。目的の細胞がスライド（ 図5B、E）から除去し、LCMキャップ（ 図5C、F）に接続されていることを確認してください。ドキュメント番目顕微鏡ツールバーの「キャプチャ画像」タブをクリックすることでプロセスです。 組織を収集し終わったら、キャップを右クリックしてキャップを削除してから、「へ移動」を選択し、「アンロードします。」 PEN膜スライドのオフ個々のドーパミンニューロンの6レーザーキャプチャー IRおよびUVレーザーの両方を使用してPEN膜スライドのオフ個々の細胞を捕捉するために、マイクロダイセクションのツールバーの「カット、キャプチャ」タブを選択します。目的の細胞をマークする「一点」タ​​ブを選択します。各セルの輪郭を描く「カットライン」タブを使用します。ステップ4.9と4.10で説明したようにIRレーザーをテストしてくださいとカットするために必要な最低限の強度を決定するために、UVレーザーをテストします（ 図4および5）PEN膜および組織を考えた顕微解剖ツールバーの「キャプチャとカット」タブを選択します。この技術を使用して個々の細胞を収集する場合であっても彼らはLCMキャップに貼付される前に切り出される場合は、最初のこれらの小片としてUVレーザーが続くIRレーザーを発射するようにしてくださいが失われることがあります。 注：このプロセスはまた、目的の点でIRレーザーを発射することによって手動で行うことができ、細胞を個別にUVレーザを用いて概説する。 上記のように目的の細胞を収集した後、細胞を除去し、キャップ（ 図6）に取り付けられたかどうかを決定するステップ5.7においてLCMキャップを移動させる。 組織を収集し終わったら、右のキャップをクリックし、 "へ移動」を選択することによりキャップを外して「アンロードします。」 7.シラン予備校スライドから腹側被蓋領域のキャプチャー関心領域を特定するには、免疫組織化学のために処理されたスライドを使用しています。 注：このデモでは腹側被蓋領域が単離されている（ 図7A）。 LCMキャップをロードし、ステップのようにレーザーをテスト4.9と4.10だ。 注：典型的には、マクロLCMキャップが使用されているが、HSキャップはまた、（ 図8を参照）を使用することができる。 顕微解剖ツールバーの「LCM」タブを選択し、シランプレップスライドから組織の領域（ すなわち、腹側被蓋領域）を単離するために、その後「ポリゴン外観」タブを選択します。ライブビデオウィンドウ内の関心領域の概要を説明します。収集のための領域の大きさによっては、低倍率（2X目的）での関心領域の概要を説明します。コレクションのために、しかし、楽器はとても前にキャプチャに10倍の対物レンズの下に赤外線レーザーを調整し、目指して10倍の対物レンズを使用しています。 顕微解剖のツールバーに – 「捕捉とカット行く」タブを選択します。 メモ：コンピュータが自動的に全体の選択した領域（ 図7F、I）全体のIRレーザーを発射します。 LCM膜が領域全体を十分に溶融されていない場合、レーザは、人間を焼成することができるuallyまたは全体のプロセスが繰り返さ。 組織を採取し、どの程度を決定するために組織のオフLCMキャップを移動します。 注：このメソッドを使用して一つのパスは通常、スライド（Figure7Gを参照してください）上の背後にあるいくつかの組織を残す。この問題が発生した場合は、上記の選択とキャプチャ手順を繰り返します。このステップを繰り返すこと（ 図7J）採取された組織の量を増やすことができます。 組織を収集し終わったら、右のキャップをクリックし、 "へ移動」を選択することによりキャップをアンロード「アンロードします。」 8. PENメンブレンスライドから腹側被蓋領域のキャプチャー上記のようにPEN膜スライド上の組織から関心領域を選択するためのガイドとして免疫組織化学のために処理したスライドを使用してください。 顕微解剖ツールバーの「カット、キャプチャ」タブを選択します。 「カットライン」タブを選択し、immunohistocheを使用して関心領域を概説ミストリーはガイドとしてスライドをラベル。 注：プログラムは自動的にキャップに組織を取り付けるためのIRレーザーのためのスポットを追加します。より良いキャップに組織を固定するために追加のスポットを追加するには「一点」タ​​ブを使用します。 10倍の対物レンズ、テスト火の下と4.9と4.10で説明したように、IRおよびUVレーザーを目指しています。 UVレーザは、スライド上の膜を貫通し、このカットは、コンピュータ画面上の位置に対応することができる試験。膜および組織を切断するだけで十分ですが、組織（ 図5）損傷しないUVレーザー強度を使用してください。 顕微解剖のツールバーに – 「捕捉とカット行く」タブを選択します。 メモ：コンピュータが自動的にスライドPEN膜および組織（ 図7C）をカットするUVレーザーを発射後、キャップに添付するために、組織内のすべてのラベルされたスポットでのIRレーザーを発射します。追加のIR溶融したスポットは十分にTISを添付する必要があるかもしれないまた、手動で追加することができますLCMキャップに訴える。 組織セクション（ 図7C）から除去され、キャップ（ 図7C）に取り付けられたかどうかを決定するために組織の外LCMキャップを移動させる。 組織を収集し終わったら、右キャップをクリックし、「へ移動」を選択し、キャップを外して「アンロードします。」 RNAの9の単離捕捉された細胞または組織からRNAを収集するために、37℃で30分間、RNA溶解緩衝液中のLCMキャップ膜をインキュベートする。 注：HSキャップの場合、アダプターはキャップ上の溶解緩衝液のみ10μlのの使用を可能にし、0.5 mlのマイクロ遠心チューブに取り付けることが可能です。マクロキャップは溶解バッファー50μlのを必要とし、0.5 mlのマイクロ遠心チューブに直接接続されます。 インキュベーション後に0.5 mlのマイクロ遠心チューブに分解、溶解緩衝液をスピン。 すべての細胞の完全な溶解を確実にするために、Or個の組織は、溶解緩衝液中でのキャップと場所のLCMキャップ膜を剥がす。 LCMは、RNAの完全性を測定するためにした後、RNAの完全性を試験するために、スライド上の残りの組織から単離されたRNAを使用しています。 注：原因LCMで得られた限られたサンプルRNAに、それは一般的にLCM単離されたRNAに、RNAの完全性をテストすることは現実的ではない、しかし、残りの組織からのRNAが原因の間に固定、免疫組織化学と時刻に任意のRNA分解の良い指標を提供していますLCM手続き。