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Neuroscienze

Laser Capture Microdissezione - Una dimostrazione dell'isolamento individuale dopamina neuroni e l'intera area ventrale tegmentale

Published: February 06, 2015
doi:
10.3791/52336
, ,
1Department of Basic Sciences,Mississippi State University College of Veterinary Medicine

Summary

L'isolamento dei singoli neuroni dopaminergici o l'area tegmentale ventrale con immunoistochimica diretta o indiretta è dimostrata tramite microdissezione laser. Parametri per isolamento di tessuto da un vetrino utilizzando un laser a infrarossi e da diapositive membrana utilizzando la combinazione di un laser infrarosso ed ultravioletto sono discussi.

Abstract

Microdissezione laser (LCM) è utilizzato per isolare una popolazione concentrata di cellule singole o precise regioni anatomiche di tessuto da sezioni di tessuto su un vetrino da microscopio. Quando combinato con immunoistochimica, LCM può essere utilizzata per isolare singoli tipi di cellule in base a un marcatore proteina specifica. Qui, la tecnica LCM è descritto per la raccolta di una specifica popolazione di neuroni dopaminergici marcate direttamente con tirosina idrossilasi immunoistochimica e per l'isolamento del neurone dopamina contenente regione tegmentale ventrale mediante immunoistochimica indiretta tirosina idrossilasi su una sezione adiacente a quelli utilizzati per LCM. Un infrarossi (IR) cattura laser viene utilizzato sia per dissezionare neuroni individuali e tegmentale ventrale off vetrini e su un tappo LCM per l'analisi. Disidratazione completa del tessuto con il 100% di etanolo e xilene è critica. La combinazione del laser IR cattura e l'ultravioletto (UV) cutting laser viene utilizzato per isolare singoli neuroni dopaminergici o tegmentale ventrale quando si utilizza PEN diapositive membrana. Una membrana diapositiva PEN presenta vantaggi significativi su un vetrino, poiché offre una migliore uniformità nel catturare e raccogliere le cellule, è più veloce raccolta di grandi pezzi di tessuto, è meno dipendente disidratazione e risultati in completa rimozione del tessuto dalla diapositiva. Anche se la rimozione di ampie aree di tessuto da un vetrino è fattibile, è molto più tempo e lascia spesso qualche tessuto residuo dietro. I dati mostrati qui dimostrano che l'RNA di quantità e qualità sufficiente può essere ottenuta utilizzando queste procedure per misurazioni PCR quantitativa. Sebbene RNA e DNA sono le molecole più comunemente isolati dal tessuto e cellule raccolte con LCM, l'isolamento e la misurazione di microRNA, proteine ​​e cambiamenti epigenetici del DNA può anche beneficiare della risoluzione anatomica e cellulare avanzato ottenuti con LCM.

Introduction

Tutti tessuto costituito da una popolazione di cellule eterozigoti. Ciò è particolarmente importante per il tessuto cerebrale, composto da diversi neuroni morfologicamente e / o neurochimico distinti circondato da vari tipi di cellule gliali (oligodendrociti, microglia e astrociti). Inoltre, diverse regioni del cervello, come le aree della corteccia o del tronco cerebrale nuclei, hanno funzioni specifiche. Pertanto, la capacità di isolare specifiche popolazioni di cellule o aree molto piccole anatomicamente distinte, quando combinato con tecniche analitiche (cioè, Q-PCR, microarray, RNA-sequenziamento, e proteomica), possono notevolmente migliorare la comprensione dei vari processi biologici. LCM è una tecnologia che prevede la possibilità di isolare zone anatomiche molto discreti o cellule specifiche dal tessuto su un vetrino da microscopio fornire una fonte molto più omogenea per ulteriori analisi di varie molecole, come RNA, microRNA, DNA e proteine.

t "> Da LCM è stato introdotto, diversi approcci sono stati utilizzati per microdissect cellule dal tessuto 1-3. I primi approcci inclusi il collegamento diretto del tessuto su un vetrino tramite infrarossi (IR) laser e un film termoplastico ed un non- metodo di contatto utilizzando un ultravioletta (UV) taglio laser per staccare una cellula o tessuto e raccolta in un tubo. Successivamente, LCM è stato usato con successo in una varietà di tessuti e tipi di cellule e mostrato compatibilità con isolamento di varie molecole per l'analisi downstream compresi RNA, microRNA, DNA e proteine, tra cui l'attività enzimatica 1,4-7. Qui LCM è dimostrato con il sistema LCM che utilizza un laser UV taglio e un laser a infrarossi cattura per il taglio intorno cellule o tessuti e collegamento a un tappo LCM rispettivamente. Questo sistema LCM utilizza sia il laser cattura IR per fondere un film plastico su un tappo sopra la cella o tessuto di interesse che si attacca alle cellule di film plastico e rimuove dal tha tessuto con la rimozione del tappo (Figura 1). Inoltre, in combinazione con il laser IR, un laser UV è disponibile per ritaglio tessuti o cellule di interesse dal tessuto montate su vetrini con una membrana poi isolato collegando il tessuto al tappo LCM utilizzando il laser IR (Figura 2). Una breve descrizione di queste tecniche si trova nelle figure 1 e 2.

Diverse varianti di questa tecnica sono descritti ad uno isolare cellule specifici utilizzando immunoistochimica fluorescenza diretta e una tecnica immunoistochimica guidato indiretta che viene usato per l'isolamento di una regione di tessuto sulla base dell'espressione di una proteina specifica. In particolare, sono presenti l'isolamento dei neuroni dopaminergici della substantia nigra e isolamento della zona tegmentale ventrale e il successivo isolamento di RNA da tessuto cerebrale fresco congelato,. Come RNA è più labile di molecole misurati (rispetto al DNA o proteine), steps per aiutare a preservare l'integrità dell'RNA sono inclusi e dati riportati sulla quantità e la qualità del RNA ottenuto.

Protocol

NOTA: il tessuto cerebrale di topi è stato utilizzato in conformità con il National Institutes of Health Guide per la cura e l'uso di animali da laboratorio, e protocolli di studio è stato approvato dal Comitato di cura e l'uso degli animali Istituzionale presso Mississippi State University. 1. Preparazione di diapositive e Tissue Utilizzare sia diapositive silano preparazione o polietilene napthalate (PEN) vetrini membrana. Per l'isolamento di RNA, diapositive tuffo in soluzione di decontaminazione RNase, lavare 3 volte con acqua RNase-free poi disidratano con una serie graduata di RNase-free etanolo e vuoto a secco per 30 minuti. Tagliare sezioni di tessuto a 10 micron di spessore con un criostato e montare sui preparati RNasi diapositive libero. Mantenere le sezioni congelate durante sezionamento per preservare la qualità RNA. NOTA: Assicurarsi che il tessuto è circa 4 mm dai bordi della diapositiva come LCM non può rimuovere il tessuto che è troppo vicino ai bordi della diapositiva. In order per rimuovere il tessuto da una membrana diapositiva PEN, garantire che il tessuto è di 4 mm da sinistra, superiore e inferiore e 7 mm dal lato destro della slitta, che sono le dimensioni della membrana che non è collegata alla slitta. Per l'isolamento delle popolazioni di cellule individuali con immunoistochimica diretta, sezione di tessuto su entrambi i vetrini Silano-prep o PEN diapositive membrana. Per l'isolamento di regioni di tessuto mediante immunoistochimica indiretta tecniche guidate, montare una serie di sezioni in una diapositiva silano preparazione per immunoistochimica e alternati su entrambi una membrana scivolo PEN e / o un vetrino silano-prep da utilizzare per LCM. 2. Tissue Preparazione Capture Laser – Rapid tirosina idrossilasi immunoistochimica per Laser Capture diretto di cellule immunoreattive Outline tessuto con una penna idrofobico e lasciare asciugare. Fissare tessuto in acetone-metanolo (1: 1) la soluzione a -20 ° C per 10 min. NOTA: Our esperienza ha dimostrato che la fissazione acetone-metanolo determinato immunoistochimica molto più consistente di acetone o metanolo solo. Scivolo Sciacquare in tampone fosfato (PBS) con 1% Triton (RNasi gratuito). Coprire le sezioni con 100-200 ml PBS con 1% Triton con anticorpo tirosina idrossilasi diluiti 1: 100 con 400 U / ml RNasin. Incubare per 5-10 minuti. Sciacquare brevemente in PBS due volte e PBS-1% Triton. Coprire il tessuto con 100-200 ml di IgG anti-coniglio di capra marcato con Alexa Fluor 488 diluito 1: 100 in PBS-1% Triton con 400 U / ml RNasin e 50 ng / ml DAPI. Incubare per 5 min. Lavare 2 volte in PBS poi disidratare 30 s in una serie graduata di RNasi libero etanolo (75% -75% -100% -95% -95% -100%). Incubare in due lavaggi di xilene per 1 minuto poi 5 min. Rimuovere i vetrini dalla xilene immediatamente prima dell'uso per LCM e lasciare asciugare. 3. Tissue Preparazione Capture Laser – tirosinaIdrossilasi immunoistochimica per indiretta Laser Capture di immunoreattive Regioni Processo una diapositiva con sezioni adiacenti alle sezioni montato su silano preparazione e / o PEN diapositive membrana per immunoistochimica. NOTA: Le procedure utilizzate qui sono simili a quelli precedentemente riportati 5. Per le immagini dimostrative, la diaminobenzidina (DAB) reazione cromogeno è stato utilizzato per visualizzare i neuroni tirosina idrossilasi di interesse. Per slides utilizzate per LCM, fissare per 5 min in 100% acetone a 4 ° C. Disidratare tessuto in una serie graduata di etanolo RNase libero (75% -75% -95% -95% -100% -100%) per 1 min ciascuna. Incubare in due lavaggi di xilene per 1 minuto poi 5 min. Rimuovere i vetrini dalla xilene immediatamente prima dell'uso per LCM e lasciare asciugare. 4. Utilizzo del Laser Capture Microdissection Sistema NOTA: Il programma applicativo LCM ha 10 bar utensili e 2 finestre per il controllo delProcedura microdissezione. Barre degli strumenti: 1. Microscopio, 2. Capture laser, 3. taglio laser, 4. Studio, 5. navigazione, 6. Materiali, 7. Capture Gruppi, 8. microdissezione, 9. Font, 10. annotazione. Di Windows: 1. Video Live e 2. Road Map. Aprire la porta selezionando la scheda "porta aperta" nella barra degli strumenti materiali a software di sistema LCM. Caricare i vetrini sui tre posti disponibili. Per questa dimostrazione, caricare una diapositiva con tirosina idrossilasi immunoistochimica visualizzata con DAB, una diapositiva silano-prep e una penna membrana scorrevole ogni etichetta per una rapida tirosina idrossilasi fluorescenti immunoistochimica. In un tipico esperimento, utilizzare le sezioni fisse o acetone senza etichetta con scivolo riferimento etichettato per tirosina idrossilasi utilizzando DAB o diapositive direttamente etichettati con fluorescente tirosina idrossilasi per la cattura laser. Caricare i tappi LCM nello slot disponibile. NOTA: tappi Macro e HS LCM sono disponibili per l'uso. Il tipo di tappo LCM utilizzare depende dal numero di cellule o quantità di tessuto da raccogliere. Vetrini macro sono elencate a raccogliere fino a diverse migliaia di cellule, mentre le protezioni HS può raccogliere diverse centinaia. Le diapositive Macro consentono più la raccolta dei tessuti ma richiedono 50 ml di tampone di lisi. Il tappo HS, quando utilizzato con gli adattatori, richiede solo 10 microlitri di tampone di lisi che consente un maggiore recupero proporzionale di RNA. Chiudere la porta. Caricare il vetrino per attivare la finestra di marcia che fornisce una vista di lavoro della intera diapositiva, questo permette la selezione della regione di interesse (Figura 3). Visualizza la tabella di marcia sulla finestra video Live per accedere alla zona di interesse. Nella barra degli strumenti materiali, individuare le diapositive membrana PEN selezionando la casella sopra lo slot diapositiva. Per fornire le proprietà cap, fate clic destro su tappi nel bar Materiali strumenti e selezionare "Proprietà di approvvigionamento Cap". Selezionare le caselle che indicano la posizione dei tappi e selezionare MaCRO o HS caps. Selezionare la scheda "fluorescenza" nella barra degli strumenti microscopio per accendere la lampada fluorescente e permettere la lampada fluorescente di riscaldarsi. Utilizza i filtri blu e UV per visualizzare l'Alex Fluor 488 e DAPI rispettivamente. Utilizzare la scheda "Adjust Camera" per aumentare la sensibilità dell'immagine, al fine di vedere le cellule fluorescente. Nella barra degli strumenti materiali, fare clic destro su un berretto e spostarlo alla diapositiva di interesse. Fare doppio clic su una posizione nella tabella di marcia per selezionare la regione che appare nella finestra Video Live. Spostare il tappo intorno sulla diapositiva selezionando un'area sulla tabella di marcia (doppio click sinistro) e poi clic destro e selezionando "Posto cap in zona centrale." Prima di utilizzare il laser cattura IR, mirare e regolare per forza. Posizionare il tappo in una regione della slitta lontano dal tessuto. Sulla barra degli strumenti Capture Laser, selezionare "Attiva". Regolare la potenza (3-100 mW), Pulse (100-1000000 μ, Sec) e # Hits del laser. Fuoco il laser IR quando il tappo è su una porzione del vetrino senza tessuti e verificare se il laser scioglie sufficientemente membrana tappo LCM. NOTA: Questo è chiamato bagnante che si sta sciogliendo la membrana polimerica sul tappo in modo che viene a contatto con il vetrino. Bagnatura sufficiente è visibile come un anello scuro fusa alla slitta con il centro dell'anello chiara (Figura 4 esempi di fusione sufficiente e insufficiente). Se bagnatura non è sufficiente, regolare la potenza e il polso, e prova al fuoco di nuovo fino a raggiungere lo scopo. Inoltre, possono essere utilizzati anche più fuochi del laser. Quando l'intensità del laser IR viene regolata, fare clic destro e selezionare "laser Capture è qui" per puntare il laser. NOTA: Questo passaggio dice al computer in cui il laser cattura IR si rivolge a tessuto. Questo passaggio di puntamento laser è critica e deve essere ripetuta ogni volta che il tappo viene spostato o l'obiettivo viene cambiato. </ol> 5. Laser Capture Microdissezione di Individual dopamina neuroni off di diapositive silano prep Spostare alla regione di interesse per catturare le cellule. NOTA: L'esempio di isolamento neuroni dopaminergici qui viene mostrato. Per catturare singole celle fuori di una diapositiva Silano-prep, selezionare la scheda "LCM", quindi l'icona "single point" nella barra degli strumenti Microdissection. Nella barra degli strumenti microscopio, utilizzare la scheda "Shutter" per passare da fluorescenza e campo chiaro con filtri fluorescenti schede per scegliere i filtri adeguati e utilizzare gli obiettivi schede per modificare l'ingrandimento. Una volta che le cellule di interesse sono visibili nella finestra video live, regolare la dimensione spot utilizzato per marcare le cellule di interesse per la dimensione approssimativa delle cellule. Fate questo facendo clic sulla scheda Spot sulla barra degli strumenti Capture Laser poi cliccando su un lato di una cellula colorata, poi facendo clic sul lato opposto. NOTA: Questo calcola ladiametro dello spot e visualizza il valore. Segnare le cellule di interesse cliccando su di loro mentre si seleziona l'icona "punto unico". Fate questo per collocare un contrassegno posto su ogni cella. Qui, il filtro blu e l'obiettivo 10X vengono utilizzati per visualizzare i neuroni dopaminergici. Ritestare e puntare il laser a infrarossi sul tappo in assenza di tessuto sotto di esso, come descritto nei punti 4.9 e 4.10. Una volta che le cellule sono contrassegnati, selezionare l'opzione "Go – taglio e cattura" scheda nella barra degli strumenti Microdissection e il laser IR si attiverà automaticamente le cellule affatto marcate selezionati. Inoltre, se necessario, sparare il laser IR manualmente in qualsiasi punto di interesse (Figura 5D). Spostare il cappuccio lontano dalla sezione e su una regione aperta del vetrino per verificare se le cellule sono state catturate sul cappuccio LCM. Assicurarsi che le cellule di interesse vengono rimosse dalla slitta (Figura 5B, E) e attaccato al tappo LCM (Figura 5C, F). Th documentoè processo facendo clic sulla scheda "Cattura immagine" nella barra degli strumenti del microscopio. Al termine la raccolta di tessuti, rimuovere il tappo con un clic destro sul tappo e selezionare "Sposta in" poi "Scaricare". 6. Laser Cattura di Individual dopamina neuroni off del PEN Slides Membrane Per catturare singole celle off di PEN diapositive membrana utilizzando sia i laser IR e UV, selezionare "Cut and Capture" scheda nella barra degli strumenti Microdissection. Selezionare la scheda "single point" per marcare le cellule di interesse. Utilizzare la scheda "Cut line" per delineare ogni cella. Assicurati di testare il laser a infrarossi come descritto al punto 4.9 e 4.10 e testare il laser UV per determinare l'intensità minima necessario tagliare pensato che la PEN membrane e dei tessuti (Figura 4 e 5) Selezionare "Cattura e Cut" scheda sulla barra degli strumenti Microdissection. Quando si raccolgono singole cellule utilizzando questa tecnica, siaAssicuratevi di sparare laser IR prima seguito dal laser UV come questi piccoli pezzi possono essere persi se vengono tagliati prima di essere applicata al tappo LCM. NOTA: Questo processo può anche essere fatto manualmente sparando il laser a infrarossi in un punto di interesse e le cellule delineato individualmente con il laser UV. Dopo aver raccolto le cellule di interesse, spostare il tappo LCM come descritto sopra nel passo 5.7 per determinare se le cellule sono state rimosse e attaccati al tappo (Figura 6). Al termine la raccolta di tessuti, rimuovere il tappo facendo clic destro sul tappo e selezionando "Sposta in" poi "Scaricare". 7. Catturare il ventrale tegmentale Area da Diapositive Silano-prep Per identificare la regione di interesse, utilizzare la diapositiva trattati per immunoistochimica. NOTA: Per questa dimostrazione l'area tegmentale ventrale è isolata (Figura 7A). Caricare un tappo LCM e testare i laser come al puntos 4.9 e 4.10. NOTA: In genere, un tappo LCM Macro è utilizzato, ma un berretto HS può essere utilizzato anche (vedere Figura 8). Per isolare una regione di tessuto (ad esempio, l'area tegmentale ventrale) dalla diapositiva Silano-prep, selezionare la scheda "LCM" nella barra degli strumenti Microdissection, quindi selezionare la scheda "poligono-esterno". Delineare la regione di interesse nella finestra Video Live. A seconda delle dimensioni dell'area di raccolta, delineare la regione di interesse a basso ingrandimento (2X Obiettivo). Per la raccolta, tuttavia, lo strumento utilizza l'obiettivo 10X in modo regolare e puntare il laser IR sotto l'obiettivo 10X prima cattura. Selezionare l'opzione "Go – cattura e taglio" scheda nella barra degli strumenti Microdissection. NOTA: Il computer scatterà automaticamente il laser a infrarossi in tutta l'area selezionata (Figura 7F, I). Se la membrana LCM non è stato sciolto sufficientemente tutta la zona, il laser può essere sparato uomodualmente o l'intero processo ripetuto. Spostare il tappo LCM fuori del tessuto per determinare quanto il tessuto è stato raccolto. NOTA: Un passaggio con questo metodo lascia in genere un po 'di tessuto dietro sulla slitta (Vedere Figure7G). In questo caso, ripetere la selezione e catturare passo sopra. Ripetendo questo passaggio può aumentare la quantità di tessuto raccolto (Figura 7J). Al termine la raccolta di tessuti, scaricare il tappo facendo clic destro sul tappo e selezionando "Sposta in" poi "Scaricare". 8. Catturare l'ventrale tegmentale Area da PEN Slides Membrane Utilizzare il vetrino trattati per immunoistochimica come guida per selezionare la regione di interesse dal tessuto sulla membrana vetrino PEN come sopra. Selezionare la scheda "Taglia e Cattura" nella barra degli strumenti Microdissection. Selezionare la scheda "Cut Line" e delineare la regione di interesse utilizzando il immunohistocheMistry etichettato diapositiva come guida. NOTA: Il programma aggiungerà automaticamente i punti per il laser a infrarossi per attaccare il tessuto al tappo. Utilizzare la scheda "single point" per aggiungere punti aggiuntivi per garantire meglio il tessuto al tappo. Sotto l'obiettivo 10X, prova al fuoco e puntare il laser IR e UV, come descritto in 4.9 e 4.10. Prova che il laser UV può penetrare la membrana della diapositiva e che questo taglio corrisponde alla posizione sullo schermo del computer. Utilizzare una forza laser UV che è appena sufficiente per tagliare la membrana e tessuto, ma non danneggia il tessuto (Figura 5). Selezionare l'opzione "Go – cattura e taglio" scheda nella barra degli strumenti Microdissection. NOTA: Il computer scatterà automaticamente il laser a infrarossi in tutti i punti contrassegnati all'interno del tessuto per fissarlo al tappo poi sparare il laser UV per tagliare la diapositiva membrane e dei tessuti (Figura 7C) PEN. Ulteriori punti fuso IR possono essere necessari per collegare adeguatamente il tiscitare in giudizio per il tappo LCM, che può anche essere aggiunto manualmente. Spostare il tappo LCM fuori del tessuto per determinare se il tessuto è stato rimosso dalla sezione (Figura 7C) e attaccato al tappo (figura 7C). Al termine la raccolta di tessuti, di togliere il tappo, fate clic destro sul cappuccio e selezionare "Sposta in" poi "Scaricare". 9. Isolamento di RNA Per raccogliere RNA dalle cellule o tessuti catturati, incubare la membrana tappo LCM in tampone di lisi RNA per 30 minuti a 37 ° C. NOTA: Per tappi SA, è disponibile un adattatore che consente l'utilizzo di soli 10 microlitri di tampone di lisi sul cappuccio e si attacca ad una provetta da 0,5 ml microcentrifuga. I tappi Macro richiedono 50 ml di tampone di lisi e attribuisce direttamente in una provetta da 0,5 ml microcentrifuga. Dopo l'incubazione, far girare il tampone di lisi giù nel tubo 0,5 ml microcentrifuga. Per garantire la completa lisi di tutte le celle otessuto r, staccare la membrana tappo LCM del tappo e posto nel buffer di lisi. Per verificare l'integrità dell'RNA, uso RNA isolato dal tessuto rimanente sul vetrino dopo LCM per misurare l'integrità dell'RNA. NOTA: A causa della RNA campione limitato ottenuto con LCM, è in genere non pratico per testare l'integrità dell'RNA su LCM isolato RNA, tuttavia, RNA dal tessuto rimanente fornisce un buon indicatore di qualsiasi degradazione dell'RNA causa di fissazione, immunoistochimica e durante la Procedura LCM.

Representative Results

La micrografia nelle figure 6 e 7 mostrano le capacità di isolamento di singoli neuroni dopaminergici. La risoluzione anatomica attuale è di circa 5-10 micron come dimensione più piccola macchia che può essere costantemente prodotto sulla LCM tappi per isolare una cella. L'unica limitazione per l'isolamento di specifici tipi cellulari è la capacità di visualizzare le cellule. Sebbene LCM è in grado di isolare singoli neuroni dopaminergici, contaminazione delle parti di cellule non marcate adiacenti più probabile si verifica. Pertanto, il campione finale è una raccolta concentrata di neuroni dopaminergici, non una popolazione pura di neuroni dopaminergici. Questa tecnologia è anche in grado di isolare piccole aree di tessuto come nuclei discreti o regioni all'interno del cervello come illustrato con l'isolamento del tegmentale ventrale. Pubblicazioni precedenti hanno dimostrato questo uso nel tessuto cerebrale e isolare tessuto patologico da tessuto normale 5,11. <pclass > Perché l'uso più comune di cellule e tessuti isolati con LCM è l'analisi di RNA, le procedure presentate sono state ottimizzate per preservare l'integrità dell'RNA. Al fine di determinare la qualità di RNA che è rimasto dopo LCM, RNA era isolato, usando colonne di rotazione basato silice, dal tessuto sugli scivoli seguenti LCM, sia dopo la procedura di immunoistochimica idrossilasi fluorescente rapida tirosina o fissazione in acetone. Qualità dell'RNA è stata misurata e confrontata con valori di RNA da disponibile commercialmente intero cervello RNA (Figura 9). Qualità RNA è stato ridotto nei campioni di RNA da tessuti utilizzati per LCM con integrità basso dopo immunoistochimica (RIN non disponibile) seguite da acetone fissaggio (RIN 2.6) rispetto al complesso RNA cervello (RIN 8.2) come risulta da una riduzione relativa altezza del picco rRNA S28 rispetto al picco S18. Tuttavia, l'RNA ha mantenuto le 18S e 28S bande e l'espressione genica potrebbe essere misurata con Q-PCR. <p class= "Jove_content"> Per misurare la quantità di RNA ottenuto da neuroni acquisiti tramite LCM, neuroni dopaminergici (50, 100 e 200 neuroni della dopamina) sono stati isolati dalla zona ventrale tegmentale off di diapositive Silano-preparazione. RNA è stato isolato usando colonne di rotazione silice base e la quantità di RNA è stato misurato. Basandosi sulla curva standard generata, per un totale di 17,3, 24,8 e 50,9 pg pg / ml è stato isolato da 50, 100 e 200 neuroni dopaminergici, rispettivamente (Figura 10A). Per misurare la quantità di RNA con Q-PCR, un intervallo di concentrazioni di RNA intero cervello e RNA dai neuroni dopaminergici stati trascrizione inversa e il gene β-actina è stata misurata utilizzando Q-PCR come descritto in precedenza 5. Sulla base di queste misurazioni, una concentrazione di 3,55, 6,82 e 20,58 pg / ml è stata calcolata da 50, 100 e 200 neuroni dopaminergici, rispettivamente (Figura 10B). Per dimostrare come l'isolamento dei neuroni dopaminergici confronta con isolamento dell'intero vArea entral tegmental con LCM, geni specifici dopamina neurone (Nurr1, tirosina idrossilasi e dopamina trasportatore) sono stati misurati con Q-PCR in questi due diversi tipi di campioni e confrontati espressione di β-actina (Figura 11). Poiché i valori t inferiore C sono generati con una maggiore concentrazione del gene di interesse, una diminuzione del ΔC t indica un aumento dell'espressione dei geni dopamina neurone relativi alla β-actina. Questo dimostra come l'isolamento dei singoli neuroni dopaminergici concentra l'espressione di geni specifici dopamina neurone. Nei campioni ventrale tegmentale, geni specifici dopamina neuroni sono diluiti come altre cellule (neuroni non dopaminergici e cellule gliali), saranno anche raccolti che esprimono β-actina, ma non esprimono geni dei neuroni dopaminergici. <strong> Figura 1. cattura laser utilizzando il laser a infrarossi (IR) cattura. Il piccolo cappuccio di plastica LCM ha una membrana sul fondo che è posto sulla parte superiore del tessuto montato su un vetrino (Passaggio 1). Quando viene identificato i tessuti o cellule di interesse, un laser a infrarossi cattura viene generato attraverso il tappo LCM di fondere una piccola fossetta nella membrana sul tessuto / cellule sottostanti (Fase 2). Quando il tappo LCM viene rimosso, il tessuto viene rimosso dal vetrino da microscopio e rimane attaccato al tappo LCM. Figura 2. Laser cattura usando l'infrarosso (IR) laser cattura e l'ultravioletto (UV) taglio laser. Per acquisire grandi aree di tessuto o facilitare il recupero delle cellule usando laser UV, il tessuto è montato su una slitta con una membrana collegata alla slitta lungo l'angolo esterno (PEN diapositive membrana). Il tappo LCM è posto su tegli tessuti e il laser cattura IR viene utilizzata per fondere la membrana tappo e attaccare il tessuto al tappo LCM (Fase 1 e 2). Il taglio laser UV viene quindi utilizzato per tagliare la membrana diapositiva e tessuti (Passaggio 3 e 4) in modo che quando il tappo viene rimosso il tessuto viene rimosso dal vetrino e rimane sul tappo LCM (Fase 5). Figura 3. La microdissezione laser Sistema Road Map. Questo Laser Capture Microdissection sistema ha spazio per 3 diapositive alla volta. Quando le diapositive vengono caricati nel microscopio, vengono generati basso ingrandimento di marcia immagini per ogni diapositiva. Selezionando una zona dell'immagine roadmap sulla sposta la finestra di Live immagine a quella regione. A scopo dimostrativo, il mesencefalo mouse è stato sezionato in 10 micron sezione su 3 scivoli. La prima diapositiva è stato etichettato per la tirosina idrossilasi immunoreactivity utilizzando diaminobenzidina come cromogeno (A). Le sezioni sono state montate su entrambi i vetrini silano preparazione (B) o diapositive membrana PEN (C). Entrambe queste diapositive sono stati etichettati con il rapido fluorescente tirosina idrossilasi immunoistochimica. Frecce in (C) indicano l'attacco della membrana PEN al vetrino. Nessun tessuto fuori dal confine può essere raccolto con LCM. Figura 4. Utilizzo del laser IR cattura. Il laser cattura IR viene utilizzata per fondere la membrana tappo LCM per fissare il tessuto al tappo LCM e rimuoverlo dal resto del tessuto. Il laser cattura IR deve essere di forza sufficiente a fondere membrana tappo LCM sufficientemente contattare il tessuto e vetro scorrevole sottostante. L'immagine qui sopra mostra quando il laser era insufficiente per sciogliere la membranaalla slitta (sinistra due punti). Quando la membrana fuso tocca il vetrino, uno spesso contorno nero può essere osservato (punto giusto). L'intensità del laser può essere regolata cambiando la potenza (3-100 mW), Pulse (100-1,000,000 msec) e # Hits del laser. Inoltre, ripetuto cottura del laser IR nello stesso punto possono anche fondere ulteriormente la membrana. Lo scopo del laser IR deve essere regolata in qualsiasi momento il tappo LCM viene spostato o quando viene cambiato l'obiettivo. Bar Scala = 100 micron. Figura 5. Utilizzo del UV taglio laser. Il taglio laser UV viene usato per tagliare attraverso la membrana e tessuti PEN. Prima di utilizzare l'intensità minima necessaria per tagliare attraverso la membrana e il tessuto deve essere stabilire poiché il laser UV può danneggiare il tessuto. Sopra, i tre punti (frecce) di diversa intensità laser UV vengono visualizzati con il dimensioni sufficienti per 10 sezioni micron, il punto centrale per le sezioni più spesse e il punto giusto dimostrando una intensità del laser UV che è troppo alto punto sinistra. Scala bar = 100 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 6. isolamento diretto di tirosina idrossilasi neuroni immunoreattivi utilizzando il laser a infrarossi. Neuroni dopaminergici vengono visualizzati dopo una marcatura fluorescente rapida per la tirosina idrossilasi (A). Quando il laser IR viene sparato fusione della membrana tappo LCM in questi neuroni (D), rimozione del tappo raccoglie queste cellule fuori della slitta (B, E). Questi neuroni possono essere visualizzati come allegato al tappo LCM (C, F). Bar Scala = 250 micron.= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/52336/52336fig6large.jpg" target = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 7. isolamento diretto di tirosina idrossilasi neuroni immunoreattivi da pen diapositive membrana utilizzando i laser IR e UV. Tirosina idrossilasi neuroni marcati sono indicati sopra (A). Questi neuroni possono essere fissati al tappo LCM utilizzando il laser IR e tagliati dalla slitta membrana PEN utilizzando il laser UV (B). Scala bar = 250 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 8. indiretta isolamento della zona ventrale tegmentale utilizzando la tirosina idrossilasi immunoreactivity. La posizione dei neuroni dopaminergici nell'area ventrale tegmentale è stata visualizzata in una sezione con tecniche di immunoistochimica normali (A ed E). Questa sezione denominata immunoistochimica è stata utilizzata come modello per individuare l'area tegmentale ventrale in sezioni adiacenti non colorate (B e F). Utilizzando il laser UV, tegmentale ventrale è stato attaccato al tappo LCM con il laser IR e tagliato dal vetrino con il laser UV (C e D) ed è mostrato collegato ad un tappo HS LCM (D). La regione tegmentale ventrale isolata dal silano prep diapositive utilizzando solo il laser a infrarossi è anche mostrato collegato a un tappo di Macro (FK). Si noti che più di un tentativo era necessaria per raccogliere maggior parte del tessuto da questa regione (Confronto G e J). Bar Scala = 500 micron.PLOAD / 52336 / 52336fig8large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 9. qualità dell'RNA. Elettroferogrammi rappresentativi e immagini gel collegati commercialmente disponibile RNA intero cervello (A) e RNA isolato da sezioni dopo fissazione e acetone LCM (B) o rapida fluorescente immunoistochimica tirosina idrossilasi e LCM (C). Sebbene la qualità dell'RNA è stata ridotta in sezioni trasformati per immunoistochimica, rispetto a tutto RNA cervello, elettroferogrammi dimostrano RNA intatto principalmente basato sulla presenza dei picchi rRNA S18 e S28. Concentrazione di RNA cervello intero era 6,487 pg / ml con un RIN di 8.2. Acetone concentrazione di RNA tessuto fissato era 5,036 pg / ml con un RIN di 2.6. RNA ottenuto dopo immunoistochimica h ad una concentrazione di 4,474 pg / ml e RIN non era disponibile. Figura 10. quantità di RNA. Per determinare la quantità di RNA in neuroni ottenuti con LCM, una curva standard di concentrazioni di RNA è stato prodotto utilizzando una fluorospectrometer e Q-PCR. Per le misurazioni fluorospectrometer (A), la grande grafico mostra la più alta gamma di valori di RNA e la piccola grafico mostra la sensibilità di questo test fino a 10 pg / ml. Le concentrazioni di RNA ottenuti da 50, 100 e 200 neuroni dopaminergici è stato 17,3, 24,8 e 50,9 pg / ml, rispettivamente. Utilizzando Q-PCR per misurare quantità di RNA (B), le concentrazioni di RNA ottenuti da 50, 100 e 200 neuroni dopaminergici è stato 3.55, 6.82 e 20.58 pg / ml, rispettivamente. es / ftp_upload / 52336 / 52336fig11highres.jpg "/> Figura 11. Concentrazione di specifici geni dopamina neurone con l'isolamento dei singoli neuroni dopaminergici. La differenza di C t (ΔC t) fra geni dopamina neuroni specifici (Nurr1, tirosina idrossilasi, e trasportatore della dopamina) e β-actina in campioni di neuroni dopaminergici nell'area ventrale tegmentale isolato con LCM rispetto all'espressione in dissezioni di tutta la regione tegmentale ventrale sono mostrati. Poiché i valori t inferiore C sono generati con una maggiore concentrazione del gene di interesse, una diminuzione del ΔC t indica un aumento dell'espressione dei geni dopamina neurone relativi alla β-actina come altre cellule (neuroni dopaminergici non e cellule gliali) sarà essere raccolti nei campioni ventrale tegmentale che esprimono β-actina, ma non esprimono geni dei neuroni dopaminergici.

Discussion

LCM è una tecnica potente per la dissezione di popolazioni discreti di cellule o tessuti da regioni di sezioni di tessuto su un vetrino da microscopio e il successivo isolamento di RNA, microRNA, DNA e proteine. L'uso di LCM in combinazione con l'analisi utilizzando tecnologie high throughput come microarray, prossima generazione sequenziamento RNA, analisi epigenetica del DNA e proteomica sta diventando sempre più comune come la sensibilità di queste tecniche migliora e la quantità di materiale di partenza necessario è ridotto 8-12. Con LCM, una migliore risoluzione anatomica si ottiene per un campione, e la comprensione da misure a valle di questi campioni è notevolmente migliorata. Un avvertimento con LCM è che fornisce un campione concentrato di cellule di interesse, ma non necessariamente una popolazione pura di cellule. I limiti della precisione significa che ci sarà qualche contaminazione da tessuti adiacenti. Tuttavia, questa tecnica non concentrare le cellule di interesseper ridurre al minimo gli effetti associati con il tessuto e le cellule circostanti e massimizzare gli effetti sperimentali sulle cellule di interesse.

Diretta contro indiretta immunoistochimica

Poiché LCM è attualmente utilizzata principalmente per l'isolamento e la misurazione di RNA, RNA mantenendo intatta è un criterio molto importante. Mantenere l'integrità dell'RNA è la logica principale dietro l'uso di immunoistochimica indiretta per guidare dissezione tessuto che elimina la necessità di macchiare direttamente il tessuto che possono degradare l'RNA (Figura 10). Quando la domanda sperimentale, tuttavia, richiede l'isolamento di una popolazione di cellule, come i neuroni dopaminergici, è necessaria immunoistochimica fluorescenza diretta. Utilizzando un protocollo rapida etichettatura immunoistochimica può minimizzare la degradazione dell'RNA durante la procedura. I brevi tempi di incubazione sono dovute all'uso di alte concentrazioni di anti primaria e secondariacorpi, le concentrazioni che sono intorno a 10-20 volte superiori a quelli di quanto necessario per immunoistochimica convenzionale con un 2 ore di incubazione. Se, tuttavia, sono necessari tempi di incubazione più lungo, Brown e Smith utilizzati tamponi di sali di inibire la degradazione dell'RNA e ottenere una buona qualità di RNA con tempi di incubazione lunghi (fino a 20 ore) 13. Questo approccio può essere utilizzato anche se c'è tempo notevole richiesto tra l'etichettatura del tessuto e l'accesso ad ottenere un sistema LCM.

Scelta di diapositive – membrana PEN, Silano-prep e vetrini non rivestiti

L'utilizzo di vetrini non patinati per LCM sono stati segnalati 14. Nel nostro laboratorio, diapositive silanici-prep sono stati trovati per essere una scelta ottimale, questo rivestimento attribuisce sufficientemente il tessuto al vetrino per immunoistochimica senza perdita di tessuto, ma consente ancora per il fissaggio del tessuto ai tappi LCM e la rimozione dalla slitta . Vetrini non rivestiti hannoha mostrato una perdita di tessuto con la procedura di immunoistochimica. Se si utilizza l'immunoistochimica indiretta, però, la conservazione dei tessuti diventa meno di un problema. Con una corretta disidratazione, cellule cattura o una velina di diapositive silano preparazione non è stato un problema. Ciascuno dei diversi approcci alla neuroni isolamento o regioni cerebrali descritti in questo documento presenta vantaggi e svantaggi. Per l'isolamento di singoli neuroni dopaminergici, l'uso di diapositive silanici-prep ha il vantaggio di ottica migliore ed è meno costoso rispetto ai vetrini membrana PEN. Lo svantaggio è che le cellule volte cattura può essere difficile se non vi è sufficiente disidratazione (vedi sotto) e alcuni tessuti può essere lasciato sul vetrino. Il vantaggio della penna membrane diapositive è che utilizzando la combinazione di laser e UV laser IR assicura che saranno raccolti i neuroni dopaminergici. La mancata raccogliere le cellule da una penna scorre membrana quasi mai si verifica, in quanto è meno dipendente disidratazione rispetto ai vetrini. Un ulteriore vantaggio è che il laser UV può essere utilizzata per approssimare più la forma dei neuroni di interesse, rispetto ad un cerchio per catturare neuroni off di vetrini con il laser IR. Per l'isolamento delle regioni di tessuto, le diapositive membrana PEN sono di gran lunga superiori e giustificano il costo aggiunto. Questo approccio risulta in completa rimozione di tutto il tessuto tagliato sulla membrana, è molto più veloce di catturare una grande area di tessuto utilizzando soltanto il laser IR e sezioni di tessuto più spesse possono essere raccolti. Utilizzando solo il laser IR richiede che la membrana tappo LCM è completamente sciolto sull'intera area del tessuto. Inoltre, la raccolta incompleta del tessuto è tipico e di solito richiede più tentativi. Anche se questo richiede più tempo di isolare il tessuto dalla membrana diapositiva PEN, se il tessuto è già disponibile su un vetrino o un laser UV non è disponibile, questa è una valida opzione come la maggior parte del tessuto possono essere raccolti (Figura 8J).

ove_content "> punti critici

Le incubazioni etanolo al 100% sono uno dei passi più importanti. Al fine di raccogliere le cellule dai vetrini silano preparazione è necessaria completa disidratazione del tessuto. Pertanto, l'acqua non rimosso, che è associato principalmente con il 100% di etanolo incubazione, influenzerà la capacità di raccogliere le cellule dai vetrini. Per affrontare questo problema, spesso cambiare le soluzioni di etanolo al 100% come l'assorbimento di acqua dal cielo o il trasferimento di fasi di lavaggio precedenti possono influenzare la disidratazione. Inoltre, setacci molecolari vengono utilizzati per assorbire qualsiasi contaminazione dell'acqua. Il sistema LCM dovrebbe idealmente essere situata in una piccola stanza con un deumidificatore per mantenere condizioni di bassa umidità.

Buone sezioni al criostato sono fondamentali per il corretto LCM. Sezioni devono essere piatta con pieghe nel tessuto minimizzato. Si ripiega nel tessuto aumenta la distanza tra il tappo LCM ed evitare di contatto tha tessuto. Diventa quindi difficile fondere sufficientemente il cappuccio della membrana sul tessuto. Per vetrini, tipicamente spessore di taglio deve essere compreso tra 6 e 12 micron. Sezioni spesse possono essere catturati con le diapositive di membrana PEN.

LCM offre una capacità tecnica di fare dissezioni molto precisi di tessuti e cellule di vetrini da microscopio. Ciò aumenta notevolmente la risoluzione di ulteriori analisi rispetto alla dissezione lordo di pezzi di tessuto. Anche se, LCM può richiedere molto tempo e laborioso, che non richiede una formazione o esperienza e, quando accoppiato con altre tecnologie high-throughput, può migliorare notevolmente la comprensione di un processo biologico in cui si utilizzano le cellule discreti o regioni anatomiche.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was funded by the National Institute of Mental Health (1R15MH084209 – 01A1), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (R21NS058375-01A2) and the National Science Foundation (DBI0723080 07070646).

Materials

Name of the Material/Equipment Company Catalog Numer  Comments
Veritas Laser Capture Microdissection System Life Technologies, Grand Island, NY Newer model is now sold
CapSure Macro LCM Caps Life Technologies, Grand Island, NY LCM0211
CapSure HS LCM Caps Life Technologies, Grand Island, NY LCM0213
PEN Membrane slides Life Technologies, Grand Island, NY s4651
Silane prep-slides Sigma-Aldrich, St. Louis, MO S4651
95% Ethanol-RNase Free Sigma-Aldrich, St. Louis, MO E7148
100% Ethanol-RNase Free Sigma-Aldrich, St. Louis, MO E7023
Rnase Free Triton Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T8787
Molecular Sieve EDM Millipore, Billerica, MA MX1583D
Anti-Tyrosine hydroxyase antibody EDM Millipore, Billerica, MA Ab152
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG Life Technologies, Grand Island, NY A-11008
2100 Bioanalyzer Agilent Technologies, Santa Clara, CA G2939AA
Stratagene MX 3005P Agilent Technologies, Santa Clara, CA 401513
Nanodrop 3300 fluorospectrometer Thermo Scientific
Quant-iT RiboGreen Life Technologies, Grand Island, NY R11490
RNaseZap Life Technologies, Grand Island, NY AM9780
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Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Kummari, E., Guo-Ross, S. X., Eells, J. B. Laser Capture Microdissection – A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area. J. Vis. Exp. (96), e52336, doi:10.3791/52336 (2015).
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