В режиме реального времени электрофизиологии: Использование замкнутой протоколы к Probe нейронов динамики и Beyond
Summary
Closed-loop protocols are becoming increasingly widespread in modern day electrophysiology. We present a simple, versatile and inexpensive way to perform complex electrophysiological protocols in cortical pyramidal neurons in vitro, using a desktop computer and a digital acquisition board.
Abstract
Экспериментальная неврологии является свидетелем повышенный интерес к разработке и применению новых и зачастую сложных, протоколов замкнутого контура, где раздражитель зависит в режиме реального времени на ответ системы. Последние приложения в диапазоне от реализации систем виртуальной реальности для изучения двигательных реакций и у мышей, 1 и 2 в данио, чтобы управлять изъятий следующих корковой инсульт, используя оптогенетика 3. Ключевым преимуществом методов замкнутым контуром находится в способности зондирующего более высокие пространственные свойства, которые непосредственно не доступны или которые зависят от нескольких переменных, таких как возбудимости нейронов 4 и надежности, в то же время, максимизируя пропускную экспериментальный. В этом вклад и в контексте сотовой электрофизиологии, мы опишем, как применять различные протоколы замкнутого контура к изучению свойств реагирования пирамидальной корковых нейронов, рекorded внутриклеточно с техникой патч зажим в острых срезах мозга от соматосенсорной коры крыс несовершеннолетних. Поскольку ни в продаже или программное обеспечение с открытым исходным кодом не обеспечивает все функции, необходимые для эффективного выполнения экспериментов, описанных здесь, новое программное обеспечение инструментов называется LCG 5 был разработан, модульная структура которого максимально повторного компьютерного кода и облегчает реализацию новых экспериментальных парадигм. Стимулирование сигналов задаются с помощью компактного мета-описание и полные экспериментальные протоколы описаны в файлах конфигурации текстовых. Кроме того, LCG имеет интерфейс командной строки, который подходит для повторения испытаний и автоматизации экспериментальных протоколов.
Introduction
В последние годы сотовой электрофизиологическое эволюционировала от традиционного разомкнутой парадигмы, используемой в напряжение и ток зажим экспериментов современных протоколов с обратной связью. Самый известный метод замкнутого контура, возможно, динамический зажим 6,7, что позволило синтетический инъекции искусственного напряжения закрытого ионных каналов, чтобы определить мембраны нейронов напряжения 8, углубленное изучение последствий недетерминированным мерцание ионные каналы по динамике нервных реагирования 9, а также отдых в пробирке реалистичных в vivo- как синаптического фоновой активности 10.
Другие парадигмы обратной связью, которые были предложены, включают реактивный зажим 11, для изучения в пробирке генерации самоподдерживающейся упорной деятельности, а ответ зажим 4,12, исследовать клеточные механизмы основной возбудимость нейронов.
ontent "> Здесь мы описываем мощный каркас, который позволяет применять различные замкнутым контуром электрофизиологических протоколов в контексте цельноклеточных записей патч зажим, выполненных в острых кусочков мозга. Мы покажем, как записать соматической мембраны напряжение с помощью патч зажим записи в пирамидальных нейронов соматосенсорной коры крыс и несовершеннолетних применить три различных протоколов с обратной связью, используя лвг, командной строки на основе программного инструментария, разработанного в лаборатории теоретической нейробиологии и Neuroengineering.Вкратце, описанные протоколы, сначала автоматической инъекции серии сигналов токов зажим стимул, имеющих отношение к характеристике большой набор активных и пассивных свойств мембраны. Они были предложены для захвата электрофизиологическое фенотип клетки по своим свойствам реагирования на трафаретной серии стимулирующих сигналов. Известный как E-код ячейки (например, см & #160; 13,14), например коллекция электрических ответов используется несколькими лабораториями объективно классифицировать нейронов на основе их электрических свойств. Это включает в себя анализ стационарного ввода-вывода передачи отношений (кривая Fi), по инновационной методике, которая включает в замкнутом контуре, в режиме реального времени контроль скорости стрельбы с помощью пропорционально-интегрально-дифференциального (ПИД) регулятора , второй отдых реалистической в естественных условиях -подобной фоне синаптической активности в препаратах в пробирке 10 и, третьей искусственного связи в режиме реального времени двух одновременно зарегистрированных пирамидальных нейронов с помощью виртуальной ГАМКергической интернейронов, который моделируется на компьютере.
Кроме того, LCG реализует метод, известный как активный электрод компенсации (AEC) 15, который позволяет реализовать динамические протоколы зажим с помощью одного электрода. Это позволяет компенсировать нежелательные эффекты (rtifacts) записывающего электрода, которые возникают, когда он используется для передачи внутриклеточных стимулов. Метод основан на непараметрического оценки эквивалентных электрических свойств схемы регистрации.
Методы и экспериментальные протоколы, описанные в этой статье, могут быть легко применены в обычных напряжения разомкнутой и текущих экспериментов зажим и может быть распространен и на другие препараты, такие как внеклеточный 4,16 или внутриклеточных записей в естественных условиях 17,18. Осторожны монтаж установки для целых клеток патч зажим электрофизиологии является очень важным шагом для стабильных, высоких записей качества. В дальнейшем мы предполагаем, что такие экспериментальные установки уже доступны для экспериментатора, и сосредоточить наше внимание на описании использование LCG. Читатель указал на 19-22 для получения дополнительных советов по оптимизации и отладки.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом тексте полный протокол для реализации в реальном времени, с обратной связью одну ячейку электрофизиологические эксперименты было описано, используя технику патч зажим и недавно разработанной программного обеспечения под названием инструментов LCG. Для оптимизации качества зап…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financial support from the Flanders Research Foundation FWO (contract n. 12C9112N to DL), the 7th Framework Programme of the European Commission (Marie Curie Network “C7”, contract n. 238214; ICT Future Emerging Technology “ENLIGHTENMENT” project, contract n. 306502), the Interuniversity Attraction Poles Program initiated by the Belgian Science Policy Office (contract n. IUAP-VII/20), and the University of Antwerp is kindly acknowledged.
Materials
| Tissue slicer | Leica | VT-1000S | |
| Pipette puller | Sutter | P-97 | |
| Pipettes | WPI | 1B150F-4 | 1.5/0.84 mm OD/ID, with filament |
| Vibration isolation table | TMC | 20 Series | |
| Microscope | Leica | DMLFS | 40X Immersion Objective |
| Manipulators | Scientifica | PatchStar | |
| Amplifiers | Axon Instruments | MultiClamp 700B | Computer controlled |
| Data acquisition card | National Instruments | PCI-6229 | Supported by Comedi Linux Drivers |
| Desktop computer | Dell | Optiplex 7010 Tower | OS: real-time Linux |
| Oscilloscopes | Tektronix | TDS-1002 | |
| Perfusion Pump | Gibson | MINIPULS3 | Used with R4 Pump head (F117606) |
| Temperature controller | Multichannel Systems | TC02 | PH01 Perfusion Cannula |
| Manometer | Testo | 510 | Optional |
| Incubator | Memmert | WB14 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | ACSF |
| KCl | Sigma | P9541 | ACSF, ICS |
| NaH2PO4 | Sigma | S3139 | ACSF |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | ACSF |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | ACSF |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | ACSF |
| Glucose | Sigma | G7528 | ACSF |
| K-Gluconate | Sigma | G4500 | ICS |
| HEPES | Sigma | H3375 | ICS |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | ICS |
| Na2-GTP | Sigma | 51120 | ICS |
| Na2-Phosphocreatine | Sigma | P7936 | ICS |
Riferimenti
- Saleem, A. B., Ayaz, A., Jeffery, K. J., Harris, K. D., Carandini, M. Integration of visual motion and locomotion in mouse visual cortex. Nature neuroscience. 16, 1864-1869 (2013).
- Ahrens, M. B., Li, J. M., et al. Brain-wide neuronal dynamics during motor adaptation in zebrafish. Nature. 485 (7399), 471-477 (2012).
- Paz, J. T., Davidson, T. J., et al. Closed-loop optogenetic control of thalamus as a tool for interrupting seizures after cortical injury. Nature neuroscience. 16 (1), 64-70 (2013).
- Wallach, A., Eytan, D., Gal, A., Zrenner, C., Marom, S. Neuronal response clamp. Frontiers in neuroengineering. 3 (April), 3 (2011).
- Linaro, D., Couto, J., Giugliano, M. Command-line cellular electrophysiology for conventional and real-time closed-loop experiments. Journal of neuroscience. 230, 5-19 (2014).
- Sharp, A., O’Neil, M., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. Journal of neurophysiology. 69 (3), 992-995 (1993).
- Robinson, H. P., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. Journal of neuroscience methods. 49 (3), 157-165 (1993).
- Vervaeke, K., Hu, H., Graham, L. J., Storm, J. F. Contrasting effects of the persistent Na+ current on neuronal excitability and spike timing. Neuron. 49 (2), 257-270 (2006).
- White, J. A., Klink, R., Alonso, A., Kay, A. R. Noise from voltage-gated ion channels may influence neuronal dynamics in the entorhinal cortex. Journal of neurophysiology. 80 (1), 262-269 (1998).
- Destexhe, a., Rudolph, M., Fellous, J. M., Sejnowski, T. J. Fluctuating synaptic conductances recreate in vivo-like activity in neocortical neurons. Neuroscienze. 107 (1), 13-24 (2001).
- Fellous, J. -. M. Regulation of Persistent Activity by Background Inhibition in an In Vitro Model of a Cortical Microcircuit. Cerebral Cortex. 13 (11), 1232-1241 (2003).
- Gal, A., Eytan, D., Wallach, A., Sandler, M., Schiller, J., Marom, S. Dynamics of excitability over extended timescales in cultured cortical neurons. The Journal of neuroscience. the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (48), 16332-16342 (2010).
- Wang, Y., Toledo-Rodriguez, M., et al. Anatomical, physiological and molecular properties of Martinotti cells in the somatosensory cortex of the juvenile rat. The Journal of physiology. 561 (Pt 1), 65-90 (2004).
- Wang, Y., Gupta, A., Toledo-Rodriguez, M., Wu, C. Z., Markram, H. Anatomical, physiological, molecular and circuit properties of nest basket cells in the developing somatosensory cortex). Cerebral cortex (New York, N.Y). 12 (4), 395-410 (1991).
- Brette, R., Piwkowska, Z., et al. High-resolution intracellular recordings using a real-time computational model of the electrode. Neuron. 59 (3), 379-391 (2008).
- Rutishauser, U., Kotowicz, A., Laurent, G. A method for closed-loop presentation of sensory stimuli conditional on the internal brain-state of awake animals. Journal of neuroscience. 215 (1), 139-155 (2013).
- Margrie, T., Brecht, M., Sakmann, B. In vivo, low-resistance, whole-cell recordings from neurons in the anaesthetized and awake mammalian brain. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 444 (4), 491-498 (2002).
- Graham, L., Schramm, A. In Vivo Dynamic-Clamp Manipulation of Extrinsic and Intrinsic Conductances: Functional Roles of Shunting Inhibition and I BK in Rat and Cat Cortex. Dynamic Clamp: From Principles to Applications. , (2008).
- Sakmann, B., Neher, E. . Single-channel recording. , (1995).
- Molleman, A. . Patch Clamping. , (2002).
- Davie, J. T., Kole, M. H. P., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nature Protocols. 1 (3), 1235-1247 (2006).
- Gold, R. . The Axon Guide for Electrophysiolog., & Biophysics Laboratory Techniques... , (2007).
- Mainen, Z. F., Sejnowski, T. J. Reliability of spike timing in neocortical neurons. Science. 268 (5216), 1503-1506 (1995).
- Buzsáki, G. Action potential threshold of hippocampal pyramidal cells in vivo is increased by recent spiking activity. Neuroscienze. 105 (1), 121-130 (2001).
- Koch, C., Segev, I. . Methods in Neuronal Modeling: From Synapses to Networks. , (1988).
- Silberberg, G., Markram, H. Disynaptic inhibition between neocortical pyramidal cells mediated by Martinotti cells. Neuron. 53 (5), 735-746 (2007).
- Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. Brief bursts self-inhibit and correlate the pyramidal network. PLoS biology. 8 (9), (2010).
- Tsodyks, M., Pawelzik, K., Markram, H. Neural networks with dynamic synapses. Neural computation. 10 (4), 821-835 (1998).
- Kapfer, C., Glickfeld, L. L., Atallah, B. Supralinear increase of recurrent inhibition during sparse activity in the somatosensory cortex. Nature. 10 (6), 743-753 (2007).
