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Biologia

Genome-wide proteína-proteína Interaction Triagem por proteína-fragmento de Complementação Assay (PCA) em células vivas

Published: March 03, 2015
doi:
10.3791/52255
, , , , ,
1Département de Biologie, Institut de biologie intégrative et des systémes & PROTEO,Université Laval

Summary

Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).

Abstract

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein’s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.

Introduction

Redes de interação proteína (PINs) oferecem um mapa de baixa resolução de como as proteínas são funcionalmente organizado na célula 1. Cada ligação física entre duas proteínas, ou da interacção proteína-proteína (PPI), pode representar uma associação que é estável no tempo, tais como aqueles encontrados dentro de complexos de proteínas e que contribuem para a organização estrutural da célula. Estas ligações podem também representar as associações transitórias que regulam a atividade, a estabilidade, a localização e as interações dos dois parceiros. Identificar os sócios de uma determinada proteína interação física, portanto, fornece informações ricas sobre a função e regulação dessa proteína 2,3. Por estas razões, grandes esforços têm sido postas em direção ao mapeamento dos PINs em organismos modelo, incluindo Escherichia coli 4-6, Arabidopsis thaliana 7, Saccharomyces cerevisiae 8-12, Drosophila melanogaster </ Em> 13, Caenorhabditis elegans 14 e Homo sapiens 15. Estes estudos têm fornecido importantes insights sobre como as proteínas são organizados na célula e, assim, informações-chave sobre proteínas com funções previamente desconhecidas.

Várias estratégias têm sido desenvolvidas ao longo dos anos para estudar PINs. Estas tecnologias podem ser agrupadas em três categorias com base no tipo de informação que fornecem sobre PPIs (revisto em 16-18). O primeiro é baseado na levedura de dois híbridos e seus derivados 19. Essas tecnologias oferecem informações sobre a associação direta entre pares de proteínas, o que permite a construção de redes de binários. A segunda família é baseado na purificação de afinidade de proteínas isco e a identificação dos seus parceiros associados, tais como purificação por afinidade seguida por espectrometria de massa 20. Estas abordagens identificar grupos de proteínas que são directamenteou indirectamente associada, geralmente de uma forma estável, e são extremamente poderosa para identificar complexos proteicos. A terceira abordagem é baseada em ensaios de complementação de proteína-fragmento (PCAs) 11,21. Esta abordagem proporciona um nível intermédio de resolução entre as duas abordagens anteriores, pois permite detectar associações diretas e proximais entre proteínas. Cada técnica tem suas próprias forças e fraquezas, como foi recentemente revisada 18.

O PIN eucariótica melhor descrito é, de longe, o da levedura Saccharomyces cerevisiae brotamento, em parte porque o seu proteoma é relativamente menos complexo do que aqueles de outros eucariotas modelo e por ensaios de elevado rendimento para detectar IPP foram primeiro testadas e são mais eficientemente implementadas neste organismo modelo 9-12. Um método particularmente eficaz para o sistema de levedura é o ensaio de proteína-fragmento de complementação di-hidrofolato redutase (DHFR-APC), um ensaio que tem sidoutilizado em diferentes contextos para estudar o PIN de levedura em condições padrão e perturbados 11,22-26. Este método baseia-se um ensaio de sobrevivência que permite a detecção de IPP directos e quase directos para uma dada proteína isco em ambos os níveis de expressão endógenos e localizações subcelulares nativas dos parceiros de interacção 11,21, de uma forma quantitativa 27. O sinal obtido com este ensaio (isto é, o tamanho das colónias de colónias em matrizes de alta densidade) reflecte, portanto, a quantidade de complexos proteicos formados entre o isco e presa num ambiente celular quase equivalente ao de células de tipo selvagem. O ensaio baseia-se na reconstituição de uma enzima repórter envolvido no metabolismo do folato, a di-hidrofolato redutase (DHFR), em que dois fragmentos complementares de DHFR que são fundidos com as duas proteínas de interesse são postos em proximidade, quando as duas proteínas interagem, que por sua vez, leva à reconstituição reversível da actividade da enzima 11 e crescimento da estirpe em meio contendo metotrexato (MTX; Figura 1). Este composto inibe a enzima DHFR endógeno, mas não o único mutante usado no ensaio de 28. Duas coleções de cepas PCA, uma contendo ~ 4.300 MATa estirpes com uma ORF fundido com o DHFR F [1,2] fragmento e uma contendo ~ 4.800 MAT α cepas com um ORF fundido com o DHFR [3] fragmento, podem ser adquiridos para implementar DHFR-PCA em pequena ou grande escala em qualquer laboratório. Aqui, descrevemos um protocolo geral, mas detalhada para a tela para PPIs entre uma proteína isca e ~ 4.800 proteínas presas com este ensaio.

Protocol

1. Construção / verificação de Isca Cepas Se a estirpe isca de interesse está disponível no MATa DHFR F [1,2] recolha, recuperá-lo a partir da recolha, conforme descrito no passo 1.1.1, caso contrário, construir a estirpe tal como descrito no passo 1.1.2. NOTA: O protocolo descrito aqui usa um DHFR F [1,2] estirpe como uma isca e o DHFR F [3] coleção como presas, como esta coleção contém mais estirpes do que a DHFR F [1,2] coleção. No entanto, é possível realizar a tela o contrário se a cepa isca só está disponível na DHFR F [3] coleção ou em ambas as orientações para obter-se uma maior cobertura do interactome. Descongelar a placa de stock de glicerol que contém a estirpe de isca em gelo durante uma hora. Esteriliza-se a folha de alumínio que cobre a placa utilizando etanol a 95%. Pierce a folha com uma ponta estéril, pipeta cima e para baixo para voltar a suspender as células e raia 2-3 ul de estoque de glicerol na seletiva peptone extrato de leveduradextrose (YPD) + 100 ug / ml Nourseothricin (Nat), a fim de isolar colónias únicas. Incubar durante dois dias a 30 ° C. Construção de uma estirpe isca PCA (MATa DHFR F [1,2]). Utilizando polimerase de alta fidelidade e um protocolo de PCR convencional, amplificar o DHFR F [1,2] cassete do plasmídeo pAG25-ligante-DHFR F [1,2] -ADHterm usando oligonucleótidos com extremidades pendendo homóloga para os últimos 40 pb da ORF de extremidade 3 'excluindo o codão de paragem (iniciador para a frente) e para os primeiros 40 pb do gene da 3'-UTR (iniciador reverso) (Figura 1A). Transformar o produto de PCR em células competentes de levedura (geralmente numa estirpe BY4741) usando o protocolo de transformação de levedura padrão LiOAc / PEG como em 29 (Figura 1A). Placa de YPD em meio selectivo + Nat para isolar transformantes positivos. Realize uma PCR colônia de diagnóstico em colônias isoladas para confirmar o bom DHFR F [1,2] fusão. Use prIMers recozimento 1) na sequência do gene que codifica (oligo) de cerca de 100 pb a montante da fusão de DHFR e 2) no terminador ADH da cassete (oligo reverso) (Figura 1B). Sequenciar o produto de PCR por sequenciamento Sanger para confirmar fusão do gene adequado. Arquivar a estirpe isca confirmada em 25% de glicerol a -80 ° C. NOTA: O protocolo pode ser interrompido a esta etapa. 2. Pin-ferramenta Procedimentos de esterilização e de impressão NOTA: O procedimento de esterilização descrito abaixo foi optimizado para as pin-ferramentas manipuladas pelo BM3-BC (S & P Robotics) plataforma robótica, mas pode ser adaptado para outras plataformas. Esta seção descreve os procedimentos de esterilização e de impressão Pin-ferramentas que são usadas para transferir células de um meio para outro para o resto do protocolo. Scripts em casa usados ​​para executar essas rotinas podem ser obtidas mediante solicitação. Nota that todas as etapas podem ser realizadas sem a necessidade de uma plataforma robótica com um pino-ferramenta manual de 30. Monte a ferramenta pin apropriado na plataforma robótica. Prepare limpeza e estações molhadas como se segue: Adicionar 500 ml de água estéril em banho-maria a estação. Adicionar 320 ml de água estéril na estação de escova. Adicionar 380 ml de etanol a 70% no sonicador durante a replicação de placa de agar (86 x 128 milímetros omnitray, contendo 35 ml de meio solidificado) a placa de ágar, ou 400 ml durante a replicação a partir de uma placa de microtitulação contendo meio líquido para uma placa de agar. Adicionar 35 ml de água estéril na estação úmida (que consiste em um omnitray vazio estéril). No início de cada dia, que requer a plataforma robótica, esterilizar as pin-ferramentas cinco vezes durante um minuto no banho de ultrassons. Enquanto isso, ligue a lâmpada UV por cinco minutos para esterilizar o gabinete de robô. Nota: Este não é necessário se o robot está alojado sob um capuz estéril. Entre cada rodada replicação pin-ferramenta, esterilizar a-ferramenta pino da seguinte forma: Embeber o pino-ferramenta cinco vezes durante 10 s na estação de banho de água para remover aglomerados de células. Mergulhe a-ferramenta pin duas vezes e para trás na estação de pincel. NOTA: A escova rotativa irá remover células residuais. Mergulhe a-ferramenta pin duas vezes durante 20 segundos na estação sonicator. NOTA: Restante células sobre os pinos serão removidos por ultra-sons ou morto por etanol. Certifique-se de que a profundidade de imersão dos pinos aumenta em cada banho sucessiva para garantir a esterilização adequada. Secar a-ferramenta pin na estação de ar secador para 25 seg. Antes de tomar as células nas placas de origem, molhar os pinos na estação úmida, que contém 35 ml de água estéril em uma omnitray. Mergulhe os pinos de duas vezes nas colônias da placa fonte. Imprimir em uma placa de destino recentemente derramado por tocar a agsuperfície ar duas vezes (doravante referida como a ação de "impressão" de um array). 3. A condensação do DHFR F [3] Collection em 1536 Arrays Usando uma plataforma robótica Automated Descongelar em gelo a DHFR F [3] de recolha (60 placas de 96 poços) e de uma placa de 96 poços adicional cheia com o DHFR de L-F [3] estirpe de controlo (Figura 1C), o qual contém o DHFR F [3] fragmento e o ligante a montante expressa sozinha como um controlo negativo. NOTA: Em princípio, este fragmento não deve interagir com qualquer proteína de fusão DHFR-fragmento (veja a discussão para mais detalhes). Placas de centrifugação (rotação rápida) antes de remover a folha de alumínio para evitar os riscos de contaminação cruzada entre os poços. Condensar a recolha para 16 matrizes de 384 estirpes (Figura 2A). Para fazer isso, para cada matriz 384, quatro placas de impressão de glicerol sobre os quatro quadrantes de um YPD selectivo + 250 ug / ml de higromicina B (HygB) omnitray usando th96 e pino-ferramenta (aqui, uma matriz 384 pode ser subdividida em quatro quadrantes igualmente intervaladas, cada um consistindo em 96 posições na matriz uma disposição de 2 x 2). Insira quatro placas de 96 poços contendo o [3] controlo negativo L-DHFR F entre as 60 outras placas, a fim de ter um conjunto final de 64 placas que exatamente preencher quatro 1.536 matrizes. Esterilizar a-ferramenta pino entre cada ciclo de replicação tal como descrito no passo 2. NOTA: Inserir a L-DHFR F [3] placas, a fim de ter uma tal placa em cada um dos quatro 1.536 matrizes finais. Incubar as placas durante dois dias a 30 ° C. NOTA: Nesta fase, a recolha de DHFR pode ser armazenado num formato de 384 a 4 ° C durante até um mês em placas de agar. Condensar a recolha em quatro matrizes de 1.536 estirpes (Figura 2A). Para fazer isso, para cada matriz 1536, imprimir quatro matrizes de 384 estirpes sobre os quatro quadrantes de uma placa da mesma forma como na etapa 3.2, utilizando a ferramenta de pin-384 (aqui, uma matriz de 1536 pode ser subdividido em quatro eQually intervalada quadrantes cada um consistindo em 384 posições em uma disposição matriz de 2 x 2). Incubar as placas durante dois dias a 30 ° C. NOTA: Nesta fase, a recolha de DHFR pode ser armazenado num formato de 1536 a 4 ° C durante até um mês em placas de agar. Replicar as quatro matrizes sobre o mesmo meio para normalizar o tamanho da colónia usando uma ferramenta pino-1536. Incubar as placas durante dois dias a 30 ° C. 4. de alta capacidade: Procedimento DHFR-PCA Inocular uma cultura da estirpe de isca (DHFR F [1,2] de fusão), obtido a partir do passo 1.1.1 ou 1.1.2, em 20 ml de líquido de YPD + Nat em um tubo de 50 ml (Figura 2B). Incubar durante dois dias a 30 ° C com agitação a 250 rpm para permitir que a cultura para atingir a saturação. Após dois dias de incubação, a placa 5 ml da cultura em um meio YPD + Nat omnitray. Vamos células adsorver na superfície durante 5-10 min e remover o excesso de líquido (Figura 2B). Repita twice para fazer três repetições. Incubar durante dois dias a 30 ° C. Imprimir a cepa isca de passos 4.3 e 4.4 em 12 placas de YPD (o suficiente para acasalamento quatro placas do DHFR F [3] de recolha × três repetições) com uma pin-ferramenta 1536 usando cada grama de células não mais do que quatro vezes. Imprimir a matriz apropriada do DHFR F [3] de recolha por cima das células de isco utilizando a ferramenta de pin-1536 (Figura 2C). Deixe as estirpes acasalar por incubação durante dois dias a 30 ° C. Selecione as células diplóides, imprimindo colônias em omnitrays contendo YPD + HygB + Nat (Figura 2C). Incubar durante dois dias a 30 ° C. Selecção diplóide Repita conforme descrito nas etapas 4.8 e 4.9 (Figura 2B). Prepare placas com meio com MTX (meio MTX) um dia antes da sua utilização seguindo estes passos 21 (ATENÇÃO:. Tenha cuidado ao trabalhar com MTX, pois é um composto tóxico Use sempre luvas, proteóculos ction e um jaleco ao manuseá-lo) (Figura 2C): Prepare os 10x Lys / TEM / ade aminoácido drop-out em água deionizada. Filtro-esterilizar o abandono de uma garrafa esterilizada utilizando um filtro de seringa estéril de 0,2 um ou, se necessário em grandes quantidades, de uma garrafa de 0,2 um funil de filtração superior (Tabela 1). Prepara-se uma solução estoque de 10 mg / ml de MTX em sulfóxido de dimetilo (DMSO). Utilizar imediatamente após a preparação da solução e congelar o restante à temperatura de -20 ° C. Proteger da luz, pois é fotossensível. Não congelar MTX novamente após a descongelação ele. Preparar os meios de comunicação como se segue (ingredientes do meio e as quantidades são os mesmos que os utilizados no Tarassov et al. 11): Para um litro de meio, misturar em dois frascos separados: 1) 6,69 g de base azotada de levedura sem aminoácidos, sem sulfato de amónio e 330 ml de água desionizada; 2) 25 g de ágar nobre e 500 ml de água desionizada. Frascos de autoclave a 121 ° C durante 20 min. Equilibrar a temperatura num banho de água a 55 ° C durante pelo menos uma hora. Misturar os dois frascos em conjunto e adicionar 50 ml de glicose esterilizada a 40%, 100 ml de 10x estéril gota-a, e 20 ml de MTX 10 mg / ml. Despeje 35 ml (ver nota abaixo) do meio em omnitrays. Vamos solidificar durante pelo menos uma hora e meia. Chapas de blindagem da luz. NOTA: Aqui, vertendo 35 ml de meio por omnitray é crítica para garantir a espessura da chapa igual, o que é importante para todos os passos a jusante. Placas de imagem a partir da segunda rodada de seleção diplóide com a plataforma robótica ou com uma câmera digital regular com iluminação placa uniforme. Utilize estas imagens para identificar posições vazias nas matrizes ao realizar a análise a jusante. Certifique-se de que os parâmetros da câmara são sempre os mesmos, e que a luz robô está ligado. Imprimir células diplóides em MTX usi mediang a pin-ferramenta 1536. Incubar durante quatro dias a 30 ° C em sacos de plástico para evitar a secagem. Prepara-se uma segunda porção de omnitrays contendo meio MTX conforme descrito no passo 4.11. Após quatro dias de incubação, as placas de imagem usando a plataforma robótica ou câmera digital regular. Certifique-se de que os parâmetros da câmara são sempre os mesmos, e que a luz robô está ligado. Realizar uma segunda rodada de seleção MTX, replicando as células no segundo lote de meio de MTX. NOTA: Isto irá diminuir o crescimento de estirpes de PCA fundo e aumentar a resolução quantitativa. Incubar durante quatro dias a 30 ° C em sacos de plástico para evitar a secagem. Placas de imagem como descrito na etapa 4.16. Análise 5. Imagem Analisar imagens de matrizes colônia com ImageJ custom 31 os scripts ou usar softwares publicados como colonizador, Ht analisador grade colônia, profiler Cell, Colony Imagemr, ScreenMill, YeastXtract e gitter (compilado em 32). A análise das imagens deve saída uma ou várias planilhas contendo tamanhos colônia para cada posição de cada matriz, use estes tamanhos colônia para todas as análises a jusante. NOTA: Neste estudo, foi utilizado um roteiro ImageJ costume descrito no Leducq et al 33 (ver seção de discussão para mais detalhes).. Análise 6. Dados NOTA: Os resultados da análise de imagem pode ser processada em uma tabulação como o Excel ou usando uma linguagem de script como R 34. Os passos seguintes descrevem o procedimento usando um costume ImageJ 31 script. Usando um script personalizado, concatenar arquivos de saída a partir de análise de imagem e anotar cada linha com a placa e coe informações como no Quadro Suplementar 1. Entrar 2 transformar os valores de tamanho de colônia (densidade Integrated ou área de colônia; aqui, na coluna "IntDenBackSub & #8221; Suplementar a partir da Tabela 1, foi utilizado). NOTA: a distribuição de valor vai olhar como na Figura 3A. Normalizar estes valores subtraindo-se o valor médio de cada placa. NOTA: Este controla passo para placa viés que pode resultar da quantidade media desigual ou variação na aquisição automática de imagem e reduz a variação inter-repetição (Figura 3B). Verificar que repetições correlacionar com o outro (Figura 3C) para avaliar a reprodutibilidade das experiências. Para diferenciar a interação de pares não interagindo bait-presa, definir um limite de alta confiança correspondente a do percentil 95 da distribuição da L-DHFR F [3] controles. NOTA: Nesta experiência, o que corresponde a 3,39 (Figura 3D). Alternativamente, um limiar baseado na sobreposição com conhecidos interactores físicas, tais como aquelas relatadas na BioGRID 35 pode ser usado.Veja a discussão para mais detalhes. Para qualquer isca, filtro presas identificado como envolvido em interações positivas falsas em telas DHFR-PCA (veja a discussão para mais detalhes) e listadas na Tabela Complementar 2 (identificado como "1" na coluna "filtrada"). Calcular a média dos Log2 tamanhos colônia normalizada das três repetições de cada interação (coluna "pontuação média" no Quadro Complementar 2). 7. Validação dos interactianos física usando experiências em pequena escala NOTA: Qualquer PPI de particular interesse ter uma pontuação acima ou perto do limiar aplicado pode ser validado utilizando o ensaio DHFR-PCA em um delineamento experimental em pequena escala utilizando um ensaio de crescimento em meio MTX sólido ou líquido. Os passos a seguir mostram o procedimento para construir manualmente cepas PCA diplóides e realizar ensaios no local em meio MTX. O experimentador deve executar essas etapas para todos necessarcontroles y (Bait-DHFR F [1,2] x L-DHFR F [3], Zipper-ligante-DHFR linhagens diplóides e ligante-DHFR diplóide). Placa 2-3 ul do estoque de glicerol da estirpe isca gerada em 1.1.2.6), o L-DHFR F [3] controle de tensão, a Zipper-ligante-DHFR e ligante-DHFR linhagens diplóides em YPD + Nat, YPD + media HygB e duas vezes YPD + Nat + HygB, respectivamente. Recuperar a presa de interesse no DHFR F [3] coleção e seguir as instruções na etapa 1.1.1, mas raia a tensão em meio ao invés de meio YPD + Nat YPD + HygB. Realize uma PCR de diagnóstico como em 1.1.2.4 para confirmar a DHFR F [3] fusion no locus presa e sequenciar o produto. Inocular 1 ml de meio YPD líquido com as estirpes haplóides para acasalar (Isca x rapina, [3] controle Isca x L-DHFR F) e crescer pelo menos dois dias a 30 ° C para permitir que os diplóides de formar. Escolha diplóides por estrias 4-5 ul da cultura em 7,4 em meio YPD + HygB + Nat sólido. Cresça dois dias a 30 ° C. Select uma colónia isolada e crescer durante a noite numa cultura líquida (1 ml) para realizar o ensaio de crescimento. Para preparar as placas de MTX e DMSO (mesmos ingredientes como meio de MTX, mas sem MTX) um dia antes do uso. Veja o passo 4.11 para mais detalhes. Realizar ensaio de crescimento por diluições em série de manchar as diferentes culturas, relativa ao controlo (DMSO), e placas de selecção (MTX). Dilui-se pré-culturas de OD = 1. Efectuar diluições em cinco vezes (até um factor de diluição de 625) em uma solução estéril de 96 poços. Spot 4 mL de cada diluição na mídia de PCA (DMSO e MTX). Incubar a 30 ° C em sacos de plástico para evitar a secagem. Placas de imagem a partir de dia 1 a 7 de incubação utilizando a plataforma robótica ou uma câmera digital comum.

Representative Results

Tabela suplementar 2 é um exemplo de resultados representativos obtidos usando a proteína de levedura fundido com o Nup82 DHFR F [1,2] fragmento como uma isca. O limiar definido com a L-DHFR F [3] controles podem ser usados ​​como um limiar empírico para determinar visitas elevados de confiança (Figuras 3D e 3E). Em alternativa, o ranking de pontuação pode ser usado para executar enriquecimentos Gene Ontologia ou outro funcional analisa 36 com base em padrões de ouro 37. Os interactores físicos conhecidos da isca pode ser recuperado a partir de bases de dados como BioGRID 35 e sobreposto sobre os dados (Figuras 3E e 3F). Neste exemplo, cinco de oito visitas de alta confiança foram previamente reportado como interagentes Nup82 e dois são parte do subcomplexo Nup82, Nup116 e Nup159 (Figura 3F e 3G). O outro membro do complexo, NSP1, não mostra qualquer Interacção em nosso experimento. Duas presas, Ade17 e Tef2 (não mostrado na Figura 3F), tiveram escores acima do limiar duro aplicado, mas estes são susceptíveis de ser falsos positivos como eles interagem com quase qualquer proteína isca em telas PCA temos realizado (resultados não publicados). Por outro lado, Pex30 pode representar um interagente física novela de Nup82 e fomos capazes de confirmar essa interação usando DHFR-PCA de baixo rendimento (Figura 3G). Pex30 é uma proteína de membrana peroxisomal e algumas interações diretas foram relatados entre o complexo do poro nuclear (NPC) e dessa organela. Um rastreio de dois híbridos identificados dois outra proteína NPC, Nup53 e Asm4 (Nup59), como interactores físicas de Pex30 38, e uma interacção genética entre Pex30 Nup170 e tem sido relatada 39. Dois outros parceiros de interação detectada, Nup120 e Nup85 (Figura 3F e 3G), não fazem parte da sub-complexo Nup82, ilustrando a capacidadeda DHFR-PCA para detectar interações dentro e entre subcomplexos em complexos maiores 11. Figura 1:. Cepas de leveduras de engenharia para alto rendimento DHFR-PCA (. Figura adaptada de Leducq et al 2012 33) (A) Construção de estirpes Mata e MAT α haplóides para fundir Gene1 (G1) e Gene2 (G2), com o DHFR F [1,2] -NatMX e o DHFR F [3] -HPH cassetes, respectivamente. As cassetes são amplificados a partir de plasmídeos pAG25-DHFR F [1,2] e pAG32-DHFR F [3] com iniciadores directos G1-5 'e G2-5', e os iniciadores reverso G1-3 'e G2-3', e, em seguida inserido no genoma na extremidade 3 'do gene alvo através de recombinação homóloga. As proteínas resultantes, P1 e P2 são, respectivamente, fundido com o DHFR F [1,2] fragmento (MATa) e o DHFR F [3] fragmento (MATa) através de um ligante flexível. (B) Verificação da construção em (A) é realizada através da sequenciação das junções entre as ORFs de Gene2 Gene1 de ee as cassetes de DHFR. As cepas construídos PCA da oposição tipos de acasalamento são então acasalado para formar um diplóide. Estirpes diplóides crescer em meio MTX se os dois fragmentos complementares de DHFR são trazidas para a proximidade por uma interacção entre P1 e P2, que reconstitui a actividade da enzima DHFR. (C) Construção de estirpes de controlo diplóide APC para telas de DHFR-PCA. Os controlos negativos (L-DHFR) são construídos por transformar estirpes MATa e MATa separadamente haplóides com plasmídeos p41-linker-DHFR F [1,2] e p41-linker-DHFR F [3] 11, respectivamente. As duas estirpes são acasaladas resultando em uma linhagem diplóide controle negativo em que os fragmentos DHFR são incapazespara complementar um ao outro (em cima). Os controlos positivos são construídas utilizando a mesma abordagem para os controles negativos, mas os plasmídeos transformado em linhagens haplóides (p41-zipper-ligante-DHFR F [1,2] (p41-ZL-DHFR F [1,2]) e p41 -zipper-ligante-DHFR F [3] (p41-ZL-DHFR F [3])) contêm fragmentos de zíper dois GCN4 leucina paralelo fundidos com os fragmentos DHFR complementares, o que leva a uma interação forte e constitutivo que reconstitui atividade DHFR (bottom ). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: de alta capacidade processo de DHFR-APC (figura adaptado de Leducq 33 et al.) (A) A MAT α DHFR F [3] de recolha. é condensado em um formato de 1536 através de duas rondas sucessivas de condensação. Primeiro, placas de ações glicerol são combinados por grupos de quatro em meio YPD + HygB seletivo em um formato de 384 usando o pin-ferramenta 96. Em segundo lugar, 384 matrizes são combinados por grupos de quatro no meio seletivo YPD + HygB em um formato de 1536 utilizando a ferramenta de pin-384. (B) gramados Celulares da isca estirpe MATa PCA são preparados por crescimento de uma cultura saturada da estirpe isca YPD seletiva + médio Nat e plaqueamento a cultura em um YPD + Nat omnitray. (C) Estas gramados são usados ​​para acasalar a cepa isca com o DHFR F [3] coleção em meio YPD. As células são sucessivamente transferido duas vezes em meio YPD + HygB + Nat selecionar para diplóides e duas vezes em meio MTX para executar PCA. O crescimento só serão obtidos em meio MTX se os fragmentos de DHFR complementam um ao outro na sequência de uma interacção entre o isco e as proteínas de presa."target =" _ E.jpg blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3:.. A análise dos dados através de passos de normalização, a determinação de um limite de significância e identificação de interacções positivas (A) Densidade de distribuição de tamanho das colónias em cada placa (log 2) (B) Normalização por a mediana de cada imagem para corrigir desvios associada com efeitos placa-a-placa. (C) Heatmap mostrando o coeficiente de correlação de Spearman entre as placas, confirmando a reprodutibilidade do processo de. (D) Distribuição de contagens para os PPIs testados e a L-DHFR F [3] controlos. Um limite rígido pode ser definida como o percentil 95 da L-DHFR F [3] de distribuição para identificar PPIs de confiança elevada (representada por uma linha vertical pontilhadadistribuição de linha). (E) ordem de classificação do escore médio de cada presa. Parceiros de interação físicos anteriormente relatados de Nup82p no BioGRID 35 são identificados por círculos e os relatados neste estudo são identificados por pontos vermelhos. O limiar definido em (D) é mostrado como uma linha pontilhada. (F) de rede que mostra os PPIs de confiança elevada identificados neste estudo. Bordas azuis mostram reportados anteriormente interagentes físicos (BioGrid 35) e bordas amarelas mostram uma interação anteriormente não declarada com Pex30. (G) ensaio Spot-diluição do PCA linhagens diplóides envolvendo Nup82-DHFR F [1,2] e presas-DHFR F [3 ] pares identificado como interagentes físicas de Nup82p no presente estudo. Ensaio de crescimento foi realizada em meio de DMSO (solvente MTX, painel esquerdo) e meio MTX (painel da direita). Os controlos negativos consistem em Nup82-DHFR F [1,2] – Ligador de DHFR-F [3] e Linker-DHFR F [1,2] – Ligador de DHFR-F [3] e um controlo positivo que consiste t-ele forte interação entre duas porções de fecho de leucina (zipper-DHFR F [1,2] – zipper-DHFR F [3]) foram incluídos. O crescimento celular superior aos controles negativos em meio MTX deve ser interpretada como uma interacção física. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Aminoácido Quantidade (g) Sulfato de adenina * 0,2 L-Triptofano 0,4 A L-tirosina 0,3 L-Fenilalanina 0,5 Ácido L-glutâmico (sal monossódico) 1.0 L-Asparagina 1.0 L-Valina 1,5 L-Treonina 2.0 </td> L-Serina 3,75 Uracile 0,2 L-histidina HCl 0,2 L-Arginina HCl 0,2 L-Metionina * 0,2 L-Lisina * 0,2 L-Leucina 0,6 * Retirado durante a execução padrão APC (tal como no presente protocolo), mas podem ser adicionados para outros fins. Tabela 1:. Composição do 10X -Lys / TEM / ade drop-out no meio MTX quantidades são para um litro de 10x drop-out. Os asteriscos indicam os compostos que devem ser retirados por meio de MTX padrão, mas que podem ser adicionados para outros fins. Quadro Suplementar. 1: Dados combinados das placas de 12 testes Tabela 1 contém a da concatenadata a partir da análise realizada utilizando o ImageJ um script ImageJ personalizado com cada linha correspondente a uma única posição em cada 1.536 matriz. Além disso, cada linha foi anotado com as informações sobre o arquivo de imagem, placa de coleta de DHFR, replicar, ORF e nome de proteína. Tabela complementar. 2: crescimento médio por estirpe normalizada A Tabela 2 apresenta a média de crescimento de log 2 normalizada para cada estirpe da colecção juntamente com o desvio padrão. Presas filtrada, hits e conhecidos interagentes físicas são identificados em colunas separadas.

Discussion

Descreve-se um protocolo baseado no teste de APC-DHFR permitindo a identificação sistemática de interactores físicos para qualquer dada proteína isco em alto rendimento. Este protocolo pode ser adaptado por rastreio para mais iscas, e isto em qualquer nível desejado de replicação. Nós demonstrar a confiabilidade deste protocolo pela identificação de parceiros de interação física para uma proteína isca envolvido no complexo do poro nuclear: Nup82. Nossa análise permitiu encontrar cinco interagentes reportados anteriormente e uma não declarada anteriormente interactors (Figuras 3F e 3G), com destaque para a capacidade do método para estudar a interactome proteína de levedura.

O protocolo descrito aqui inclui várias etapas críticas a que o pesquisador deve prestar atenção. Recomendamos a 1) Certifique-se de que a DHFR isca F [1,2] fusão está correta (Figura 1B); isto pode ser conseguido por sequenciação da construção e MEASURing expressão da proteína apropriada utilizando um anti-DHFR F [1,2] ou anti-DHFR F [3] de anticorpo; 2) Antes de iniciar a tela, é recomendado para verificar se alguma isca de interesse exibe interações promíscuas em telas PCA. Isto pode ser realizado através de ecrãs de controlo com iscos cruzadas com o controle L-DHFR adequado ou por meio de cruzamentos manualmente a isca com o controlo G-DHFR adequado e realizando um ensaio de crescimento em meio MTX. 3) As placas devem ser vertida no dia antes de serem usados ​​de modo a que a humidade é óptima para a adesão de células sobre a superfície de agar durante o processo de impressão; 4) placas de origem não deve ser usado mais do que quatro vezes para transferir células suficientes na placa de destino. Aumentando o número de cópias da placa de destino pode ser feito por passos sucessivos de expansão (por exemplo, 4 copia -> 16 -> 64 cópias cópias). Alternativamente, as células podem ser colhidas em diferentes posições nos gramados ou na colônia entre os diferentes ciclos de replicação; 5) Se vários positions estão desaparecidas após a seleção diplóide (s), certifique-se de que as placas de origem não foram usadas muitas vezes na etapa de acasalamento (passos 4,5-4,7); 6) Certifique-se de que o meio MTX contém todos os ingredientes essenciais nas concentrações adequadas. Com efeito, se nenhum crescimento é observado no meio MTX, pode ser quer porque nenhuma interacção é detectável por meio da PCA para as proteínas de interesse ou porque o meio de MTX não foi devidamente preparado. Para garantir que o meio permite o crescimento de estirpes que mostram fragmentos de DHFR complementação, uma interacção constitutiva pode ser adicionado em posições vazias da recolha e utilizada como um controlo positivo, tal como DHFR-fragmentos fundidos com leucina zipper porções 33 (Figura 1C). Testes paralelo usando os fragmentos ligante-DHFR ou os fragmentos zipper-ligante-DHFR permitirá discriminar entre as condições que permitem que todas as células a crescer (baixa concentração de MTX ou proteína isca que tendem a tornar as interações de falsos positivos, como described abaixo) e condições que evitam o crescimento de todas as estirpes (ingrediente concentração de MTX muito elevada ou ausente no essencial a forma); 7) Uma vez que PCA é realizada através de sucessivas rodadas de repetições de um meio para outro, a contaminação cruzada entre as cepas entre diferentes placas podem ocorrer se, por exemplo, a ferramenta pino não é esterilizado adequadamente entre as rodadas de replicação e / ou a última água banho (ie estação úmida) no procedimento de esterilização está contaminada por colônias de rodadas de replicação anteriores. Várias posições sobre as matrizes estão vazias e podem, assim, ser usado como posições de controle onde há crescimento devem ser observados para detectar contaminações cruzadas.

A análise das imagens pode ser realizada utilizando vários softwares publicados (ver seção 5 do protocolo) ou qualquer script personalizado. Neste estudo, o script personalizado executa os seguintes passos: 1) O script subtrai os valores de pixel de uma placa vazia para o pixel os valores de cada uma das placas de modo a correct para vieses de iluminação. 2) O script converte cada imagem com correção de fundo para binário usando um limiar de valor de pixel de 10. 3) para cada 1.536 posições de cada placa, determinados através da sobreposição de um retângulo sobre as colônias de ponta, o script é executado ImageJ "Analisar partículas … função "em uma seleção circular. A selecção circular é definida com um raio igual ao intervalo entre duas posições menos 10 pixels. 4) O script selecciona a partícula mais próximo do centro da selecção e confirma-se que uma colónia sua localização não é mais do que metade do intervalo entre duas colónias de distância a partir do centro da selecção. 5) O script mede os valores de pixel da partícula seleccionado na imagem corrigida-fundo. 6) Para corrigir ainda mais qualquer restantes preconceitos iluminação de fundo, o script subtrai o valor médio de todos os pixels da seleção circular que não faziam parte de uma partícula de valores de pixel da colônia. A soma destes valor de pixel corrigidos armazenadas na coluna "IntDenBackSub" da Tabela Suplementar 1, são usadas como uma medida do tamanho da colónia.

Um passo essencial na parte de análise é a escolha do limiar de significado. Aqui, nós escolhemos um limiar com base na distribuição da L-negativo DHFR F [3] controlos, mas, dependendo do objectivo da tela, tal limiar pode ser muito restritos. De facto, a L-DHFR F [3] controlos são sobre-expressos (TEF forte promotor) de tal modo que os fragmentos complementares podem complementar espontaneamente uns aos outros e, assim, estes não são representativas da expressão da maior parte das proteínas. Isto é realçado pelo facto de a distribuição da L-DHFR F [3] controlos é mais elevada do que a média do crescimento do fundo (Figura 3D). Assim, algumas interacções com pontuações inferiores a esse limiar rigorosa mas que são claramente fora da distribuição de crescimento de fundo pode ser considerado como sucessos putativos que podem representar, por exemplo, entre transiente ou fracoações. Estes podem ser mais estudada e validadas se, por exemplo, as duas proteínas não são expressos em níveis que podem permitir a complementação espontânea dos fragmentos de DHFR como os controlos L-DHFR. Como alternativa, pode-se prever um limite de significância com base na proporção de sobreposição com interactores físicas relatadas em bases de dados como BioGRID 35, a fim de maximizar a proporção de verdadeiros positivos sobre falsos positivos. No entanto, ao contrário da utilização da distribuição de L-DHFR, esta alternativa pode não ser sempre possível se, por exemplo, o número de conhecidos interactores físicas não é suficientemente elevada. Além disso, a escolha do limiar de significado tem um impacto sobre a proporção de falsos positivos e falsos negativos, no conjunto de dados final. Com efeito, como qualquer outro ensaio de detecção de PPI, os falsos positivos podem resultar da interacção não específica de uma proteína com a proteína de fusão de DHFR-se, por exemplo, a proteína é altamente abundante, como mencionado anteriormente. Esteé exemplificado pelo facto de cerca de presas interagem sistematicamente com todas as proteínas de isco em telas de APC e, deste modo, a necessidade de ser removido a partir da análise de 11 (por exemplo Tef2 e Ade17 e Tabela 2 Complementar). Para contornar esse problema, uma tela de controle PCA das duas coleções contra o controle L-DHFR apropriada (F [1,2] ou F [3]) para identificar iscas e presas expositoras espontânea DHFR fragmenta complementação pode ser realizado nas condições específicas de cada tela. Além disso, realizando uma análise de enriquecimento Gene Onto- pode aumentar a confiança dos dados, se a função de uma dada isca é conhecido. Por outro lado, a DHFR-PCA pode dar origem a falsos negativos por várias razões: 1) não todas as proteínas podem ser fundidas aos fragmentos de DHFR como estes podem destabilizar as proteínas ou modificar a sua localização, se, por exemplo, a fusão de DHFR para a C-terminal interfere com um sinal de localização; 2) a reconstituição de DHFR em alguns compartimentos celulares may não produzir folato se, por exemplo, um precursor essencial para a síntese de ácido fólico não está disponível; 3) C-terminais necessidade de estar a uma distância de 8 nm para DHFR complementação para ocorrer 11. Assim, uma interacção bem conhecido não pode ser detectado se seus terminais C não são suficientemente perto no espaço. Isto é exemplificado aqui pelo fato de que uma grande fracção das interacções físicas Nup82 relatados em bancos de dados, a maioria dos quais são indirecta, não foram detectadas no nosso ensaio. Do mesmo modo, as interacções entre as proteínas da membrana para que os C-terminais estão em trans em relação à membrana não irá levar a DHFR fragmentos de complementação e não será detectado 11. Limitações 1) e 3) pode ser contornada de maneira relativamente simples por meio da fusão do fragmento de DHFR para o terminal N da proteína. Se o fizer, pode impedir a interferir com um sinal de localização perto do C-terminais e pode permitir detectar uma interação entre as proteínas da membrana cujos N e C-terminal são em relação cispara a membrana.

Vários desafios permanecem no estudo de PINs (revisto em 2,3). Os mapas de PINs produzidos até agora têm sido amplamente descrito em uma condição experimental único para cada espécie e, assim, oferecer um único instantâneo de como as redes de proteína pode ser organizado. Há, portanto, uma necessidade para a exploração de outras condições experimentais para ver como PINs podem ser reorganizados em resposta a mudanças ambientais, estímulos específicos, através de desenvolvimento ou seguintes mutações. Estes desafios será resolvido pelo desenvolvimento de novas tecnologias de interrogação de IPP em tempo real, em células vivas e por adaptar as técnicas actuais, de modo que eles podem ser utilizados por uma comunidade mais ampla de laboratórios. Como uma técnica quantitativa que pode detectar alterações na quantidade de complexos de DHFR complementação 27, DHFR-PCA pode ser adaptado para superar estes desafios e tem sido utilizado para estudar o modo como os IPP são afectados por um agente de ADN 22 danificando </sup> 25, agentes químicos, deleções de genes 23,26 ou em outras espécies de leveduras e seus híbridos 33. Explorando estas novas dimensões vai se tornar cada vez mais importante para revelar a dinâmica do PIN.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado pelo Instituto Canadense de Pesquisa em Saúde (CIHR) Concede 191597, 299432 e 324265, um Ciências Naturais e Council of Canada Descoberta concessão de Pesquisa em Engenharia e uma bolsa Frontier Science Program Humano à CRL. CRL é um CIHR New Investigator. Guillaume Diss é apoiado por uma bolsa PROTEO. Samuel Rochette é suportado por NSERC e FRQNT bolsas.

Materials

Name of Material/Equipement  Company  Catalog Number  Comments/Description
BioMatrix Robot, Bench-top Configuration S&P Robotics Inc. BM5-BC
96-format Pin-tool S&P Robotics Inc. PH-96-10 Standard 96-format Pin-tool with 96 high-precision floating pins
384-format Pin-tool S&P Robotics Inc. PH-384-10 Standard 384-format Pin-tool with 384 high-precision floating pins
1536-format Pin-tool S&P Robotics Inc. PH-1536-05 Custom 1536-format Pin-tool with 0.5mm high-precision floating pins
Automated imaging module  S&P Robotics Inc. IMG-02
Methotrexate  Bioshop Canada Inc. MTX440  CAUTION: toxic compound
Hygromycin B  Bioshop Canada Inc. HYG003
Nourseothricin dihydrogen sulfate Werner BioAgents 5010000
Yeast-Interactome Collection  Thermo Scientific YSC5849
Omni Tray w/lid sterile  Thermo Scientific 242811
Anti-DHFR F[1,2] antibody  Sigma-Aldrich D1067
Anti-DHFR F[3] antibody   Sigma-Aldrich D0942
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Rochette, S., Diss, G., Filteau, M., Leducq, J., Dubé, A. K., Landry, C. R. Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells. J. Vis. Exp. (97), e52255, doi:10.3791/52255 (2015).
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