살아있는 세포의 단백질 조각 보완 분석 (PCA)에 의해 게놈 전체 단백질 - 단백질 상호 작용 상영

1. 건설 / 미끼 균주의 확인 관심있는 미끼 변형 마타 DHFR F [1,2] 컬렉션에서 사용할 수있는 경우는 1.1.1에 기술 된 바와 같이, 단계 1.1.2에 설명 된대로, 그렇지 않으면 변형을 구성, 컬렉션에서 검색. 참고 :이 컬렉션은 DHFR F [1,2] 컬렉션보다 더 많은 균주가 들어 있으므로 여기에 설명 된 프로토콜, DHFR F할까요 등의 미끼와 DHFR F [3] 수집 등 [1,2] 변형을 사용합니다. 그러나, 하나는 상호 작용 체의 높은 범위를 필요로하는 경우 미끼 변형이 DHFR F [3] 컬렉션 또는 양쪽 방향으로 만 사용할 수있는 경우 주위의 화면을 다른 방법으로 수행 할 수있다. 한 시간 동안 얼음에 미끼 균주를 포함하는 글리세롤 스톡 판을 녹여. 95 % 에탄올을 사용하여 플레이트를 덮는 알루미늄 박 멸균. 피어스 살균 팁과 호일, 선택적 효모 추출물 펩톤에 글리세롤 주식의 세포와 행진 2-3 μl를 재현 탁 아래로 피펫덱스 트로 오스 (YPD) + 100 μg의 단일 콜로니를 분리하기 위해 / ㎖ Nourseothricin (NAT). 30 ° C에서 이틀 동안 품어. 미끼 PCA 균주의 건설 (마타 DHFR F [1,2]). 플라스미드 pAG25 링커-DHFR F에서 DHFR F를 증폭, 고성능 폴리머 라제 및 표준 PCR 프로토콜을 사용하여 [1,2] 카세트 [1,2] -ADHterm 걸리 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 ORF의 마지막 40 BP 상동 단부 종료 코돈 (정방향 프라이머)와 유전자의 3'-UTR (역방향 프라이머) (도 1a)의 제 40에 BP 제외 3'- 말단. (29) (도 1a)에서와 같이 표준 LiOAc / PEG 효모 변환 프로토콜을 사용 (일반적으로 변형 BY4741) 유능한 효모 세포 내로 PCR 생성물을 변형. 선택적 YPD + 냇 매체에 플레이트 긍정적 인 형질 전환 체를 분리합니다. 적절한 DHFR F [1,2] 융합을 확인하기 위해 고립 된 식민지에 진단 식민지 PCR을 수행합니다. 홍보 사용imers 유전자 코딩 서열 (앞으로 올리고) DHFR 융합의 상류 약 100 bp의 2) 카세트 (올리고 역) (그림 1B)의 ADH 종료에에) 1 어닐링. 적절한 유전자 융합을 확인 생거 시퀀싱함으로써 PCR 생성물 시퀀스. -80 ° C에서 25 % 글리세롤에서 확인 미끼의 피로를 보관합니다. 참고 : 프로토콜이이 단계에서 일시 중지 할 수 있습니다. 2. 핀 도구 살균 및 인쇄 절차 주의 : 아래에 기재된 멸균 절차 BM3-BC (S & P 로보틱스) 로봇 플랫폼에 의해 조작 핀 – 툴에 최적화되었지만, 다른 플랫폼에 적용 할 수있다. 이 절에서는 프로토콜의 나머지 다른 하나의 매체에서 세포를 전송하는 데 사용되는 핀 – 도구 살균 및 인쇄 절차에 대해 설명합니다. 이러한 루틴을 수행하는 데 사용 사내 스크립트는 요청에 따라 얻을 수있다. 참고 그쪽으로t는 모든 단계는 수동 핀 도구 (30)를 이용하여 로봇 플랫폼의 필요없이 수행 될 수있다. 로봇 플랫폼의 해당 핀 도구를 탑재합니다. 다음과 같이 청소와 습식 스테이션을 준비합니다 : 물 목욕 역에서 멸균 물 500㎖를 추가합니다. 브러시 역에서 멸균 320 ML을 추가합니다. 한천 플레이트에 액체 문화를 포함하는 마이크로 타이 터 플레이트에서 복제 할 때 한천 플레이트, 400 ㎖ (응고 매체의 35 ml의를 포함, 86 X 128mm의 omnitray) 한천 플레이트에서 복제 할 때 초음파기에 70 % 에탄올 380 ML을 추가합니다. 젖은 역 (멸균 빈 omnitray으로 구성)에서 멸균 35 ML을 추가합니다. 로봇 플랫폼을 필요로 하루의 시작 부분에서, 초음파기 목욕 한 분 동안 핀 도구를 다섯 번 소독. 다섯 분은 로봇 인클로저를 소독하는 한편, UV 램프를 켭니다. 참고 :이 강탈 경우 필요하지 않습니다오티는 멸균 후드 아래에 보관되어 있습니다. 다음과 같이 각각의 핀 도구 복제 라운드 사이에, 핀 도구를 소독 : 세포 덩어리를 제거하기 위해 물 목욕 역에 핀 도구 10 초 동안 다섯 번 담근다. 두 번 앞뒤로 브러시 역에 핀 도구를 만끽 해보세요. 참고 : 회전 브러시 잔여 세포를 제거합니다. 초음파기 역에서 20 초 동안 두 번 핀 도구를 만끽 해보세요. 참고 : 핀에 세포를 나머지는 초음파에 의해 제거 또는 에탄올에 의해 살해 될 것입니다. 핀의 침지 깊이가 적절한 살균을 보장하기 위해 각 연속 욕조에서 증가 있는지 확인합니다. 25 초 동안 공기 건조기 역에 핀 도구를 건조. 소스 접시에 세포를 복용하기 전에, omnitray에 멸균 물 35 ㎖에 들어있는 습식 역에 핀을 젖은. 소스 판에서 식민지에서 두 번 핀을 찍어. AG을 터치하여 갓 부 대상 접시에 인쇄AR 표면 회 (이하 "프린트"어레이의 동작이라 함). 자동화 된 로봇 플랫폼을 사용하여 1536 배열의 DHFR F [3] 컬렉션의 3. 응축 얼음에 해동 DHFR F [3] 모음 (60 96 웰 플레이트)와 L-DHFR F [3] 제어 변형 DHFR F를 포함한다 (그림 1C), [3] 조각으로 가득 추가로 96 웰 플레이트 상류 링커 음성 대조군 단독 표현. 참고 : 원칙적으로,이 조각은 D​​HFR 단편 융합 단백질 (자세한 내용은 설명을 참조)과 상호 작용하지 않아야합니다. 우물 사이의 교차 오염의 위험을 방지하기 위해 알루미늄 호일을 제거하기 전에 원심 분리 판 (빠른 회전). 384 균주 (그림 2A)의 16 배열에 컬렉션을 응축. 이렇게하려면 각 384 배열, 선택적 YPD + 250 ㎍ / ㎖의 하이 그로 마이신 B (HygB)의 네 사분면에 인쇄 네 개의 글리세롤 판은 일을 사용 omnitray즉 핀 (96)은 공구 (여기서, 어레이 (384)는 각각의 2 × 2 매트릭스 (96)의 위치에 배치 이루어진 네 개의 사분면에 똑같이 interspaced 세분 될 수있다). 정확히 네 1,536 배열을 채우기 64 판의 최종 세트를 가지고하기 위해 60 다른 판 사이에 L-DHFR F [3] 음성 대조군을 포함하는 4 개의 96 웰 플레이트를 삽입합니다. 단계 2에 기재된 바와 같이 각각의 복제주기 사이 핀 도구 멸균. 참고 : 최종 4 1536 배열에 각각 하나의 판을하기 위해 L-DHFR F [3] 플레이트를 삽입합니다. 30 ° C에서 이틀 동안 번호판을 품어. 주 :이 단계에서는, DHFR 컬렉션 한천 플레이트상에서 최대 한 달 동안 4 ℃에서 (384)의 형식으로 저장하는 것이 가능하다. 1536 균주 (그림 2A)의 네 개의 배열로 컬렉션을 응축. 이렇게하려면 각 1536 배열, 여기에 (384 핀 도구를 사용하여 단계 3.2에서와 같은 매체의 판의 네 사분면에 384 균주의 네 배열을 인쇄, 1536 어레이는 네 개의 전자로 분할 될 수있다qually)는 2 × 2 행렬 배치에서 각각의 위치 (384)로 구성된 사분면 interspaced. 30 ° C에서 이틀 동안 번호판을 품어. 주 :이 단계에서는, DHFR 컬렉션 한천 플레이트상에서 최대 한 달 동안 4 ℃에서 1536 형식으로 저장 될 수있다. 1536 핀 도구를 사용하여 콜로니 크기를 표준화 동일한 매체 상에 네 개의 배열을 복제. 30 ℃에서 이틀 동안 번호판을 품어. 4. 높은 처리량 DHFR-PCA 절차 50 ML 튜브 (그림 2B)에 액체 YPD + 냇 20ml에 1.1.1 또는 1.1.2에서 얻은 미끼 변형 (DHFR F [1,2] 융합)의 문화를 접종한다. 문화가 포화에 도달 할 수 있도록 250 rpm으로 진탕하면서 30 ℃에서 이틀 동안 배양한다. 배양 이틀 판 후 YPD + NAT에서 문화의 5 ml의 omnitray. 세포는 5 ~ 10 분 동안 표면에 흡착하자 초과 액체 (그림 2B)를 제거합니다. 반복 twice 세 가지 반복 실험을합니다. 30 ° C에서 이틀 동안 품어. 네 번 이상 더 이상 각 셀의 잔디를 사용하여 1536 핀 도구 (DHFR F [3] 수집 × 세 복제물 4 판 짝짓기에 충분한) 단계 4.3 및 4.4 12 YPD 플레이트에서 미끼 부담을 인쇄합니다. 1536 핀 도구 (도 2C)를 사용하여 미끼 셀 위에 DHFR F [3] 컬렉션의 적절한 배열을 출력한다. 균주는 30 ° C에서 이틀 동안 배양하여 짝짓기를 보자. YPD + HygB + 냇 (그림 2C)를 포함 omnitrays에 식민지를 인쇄하여 이배체 세포를 선택합니다. 30 ° C에서 이틀 동안 품어. 단계 4.8 및 4.9 (그림 2B)에 설명 된대로 반복 배체 선택. .이 독성 화합물로 MTX로 작업 할 때 반드시 장갑을 착용주의, 보호 자전거 : MTX (MTX 매체) 일을 포함하는 미디어를 사용하기 전에 다음 단계 21 (주의를 다음과 같이 판을 준비ction의 안경을 처리 실험실 코트) (그림 2C) 10 배 -Lys 준비 / 탈 이온수 / 에이드 아미노산 드롭 아웃을 만났다. 대량으로 필요한 경우, 0.2 μm의 병 상단 여과 깔때기 (표 1) 0.2 μm의 멸균 주사기 필터를 사용하여 멸균 병의 드롭 아웃 필터 소독 또는. 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 10 ㎎ / ㎖ MTX 스톡 용액을 준비한다. 용액을 제조 후 즉시 사용을 -20 ° C에서 나머지 동결. 이 감광 그대로 빛으로부터 보호. 를 해동 후 MTX 다시 냉동하지 마십시오. 다음과 같다. (배지 성분 및 수량 등 Tarassov 11에 사용 된 것과 동일) 미디어 준비 : 매체의 일 리터, 두 개의 분리 된 플라스크에서 혼합한다 : 1) 아미노산 않고 황산 암모늄이없는 효모 질소 염기 6.69 g 및 탈 이온수 330 ㎖; 탈 이온수의 한천 고귀하고 500 ml의 2) 25g. 20 분 동안 121 ° C에서 압력솥 플라스크. 적어도 한 시간 동안 55 ℃에서 수욕 온도를 평형화. 두 플라스크를 함께 혼합하고 살균 40 % 포도당 50ml의 100 배 살균 드롭 아웃 ml의 MTX 10 ㎎ / ㎖의 20 ㎖를 추가합니다. 35 ㎖를 붓고 omnitrays 매체의 (아래 참고 참조). 적어도 한 시간 반 동안 응고하자. 빛의 차폐 판. 참고 : 여기에, omnitray 당 배지 35 ml를 붓는 것은 모든 다운 스트림 단계에 중요 동일한 판 두께를 확인하는 것이 중요합니다. 로봇 플랫폼 또는 균일 한 판 조명과 일반 디지털 카메라와 함께 배체 선택의 두 번째 라운드에서 이미지 플레이트. 다운 스트림 분석을 수행 할 때 배열에 빈 위치를 식별하기 위해이 사진을 사용합니다. 카메라의 매개 변수가 항상 같은 로봇 표시등이 켜져 있는지 있는지 확인하십시오. MTX 미디어 USI에 이배체 세포를 인쇄1536 핀 도구 겨. 건조를 방지하기 위해 비닐 봉지에 30 ° C에서 나흘 품어. 단계 4.11에 설명 된대로 MTX 매체를 포함 omnitrays의 두 번째 배치를 준비합니다. 인큐베이션 나흘, 이미지 판은 로봇 플랫폼 또는 일반 디지털 카메라를 사용. 카메라의 매개 변수가 항상 같은 로봇 표시등이 켜져 있는지 있는지 확인하십시오. MTX 미디어의 두 번째 배치에 세포를 복제하여 MTX 선택의 두 번째 라운드를 수행합니다. 참고 :이 PCA 균주의 배경 성장을 감소시키고 정량적 해상도를 증가시킬 것이다. 건조를 방지하기 위해 비닐 봉지에 30 ° C에서 나흘 품어. 같은 이미지 플레이트 단계 4.16에 설명. 5. 이미지 분석 사용자 정의 ImageJ에 31 개의 스크립트를 식민지 배열의 이미지를 분석하거나 식민지 개척자, 하프 타임 식민지 그리드 분석기, 셀 프로파일, 식민지 이미지로 출판 소프트웨어를 사용하여(32 컴파일) R, ScreenMill, YeastXtract 및 gitter. 이미지 분석은 하나의 또는 각각의 출력 어레이의 각 위치에 콜로니 크기를 포함하는 여러 스프레드 시트는, 모든 다운 스트림 분석 이러한 콜로니 크기를 사용한다. 참고 :이 연구에서 우리는 Leducq 등에 설명 된 사용자 정의 ImageJ에 스크립트를 사용 (33) (자세한 내용은 토론 섹션을 참조).. 6. 데이터 분석 주 : 이미지 분석의 결과는 엑셀 또는 R (34) 등의 스크립트 언어를 사용하는 것으로 태뷸에서 처리 될 수있다. 다음 단계는 사용자 정의 ImageJ에 31 스크립트를 사용하여 절차를 설명합니다. 커스텀 스크립트를 사용하여, 화상 해석의 출력 파일을 연결하고, 플레이트에 각 행에 주석을 부가하고 표 1과 같은 정보를 걸러. 콜로니 크기 값 (통합 밀도 또는 콜로니 면적이 로그 변환 여기서, 열 "을 IntDenBackSub & #8221; 보충 표 1)를 사용했다. 참고 : 값 분포는도 3a에서와 같이 보일 것이다. 각 플레이트의 중간 값을 감산함으로써 이들 값을 정규화한다. 참고 : 자동 이미지 획득의 불평등 미디어 수량 또는 변화의 결과 및 간 복제 분산 (그림 3B)를 줄일 수있다 플레이트 바이어스에 대해이 단계를 제어합니다. 반복 실험이 실험의 재현성을 평가하기 위해 서로 (그림 3C)와 상관 관계가 있는지 확인합니다. 비 상호 작용 미끼 먹이 쌍에서 상호 작용을 구분하기 위해, L-DHFR F [3] 컨트롤의 분포의 95 번째 백분위 수에 해당하는 높은 신뢰도 임계 값을 설정합니다. 주 :이 실험에서, 이는 3.39 (도 3d)에 대응한다. 대안 적으로, BioGRID 35에보고 된 것과 알려진 실제와 인터랙 오버랩에 기초하여 임계치가 사용될 수있다.자세한 내용은 설명을 참조하십시오. DHFR-PCA 화면에서 거짓 긍정적 인 상호 작용에 관여 (자세한 내용은 설명을 참조)과 (열에서 "1"로 식별 "필터링") 보충 표 2에 나와있는 어떤 미끼를 들어, 필터가 확인 먹이한다. (보충 표 2에 열 "평균 점수")의 각각의 상호 작용의 세 복제물의 LOG2 정규화 된 식민지 크기 평균값. 물리적 인터랙 7. 검증 작은 규모의 실험을 사용하여 주 : 상기 스코어 또는 고체 또는 액체 MTX 매체 성장 분석을 이용하여 소규모 실험 설계에서 DHFR-PCA의 분석을 이용하여 검증 할 수있는 적용에 가까운 임계 특히 관심을 갖는 임의의 PPI. 아래 단계 수동 이배체 PCA 균주를 생성하고 MTX 매체 상에 스폿 분석을 수행하는 절차를 나타낸다. 실험자는 모든 necessar에 대해이 단계를 수행해야합니다Y 컨트롤 (미끼-DHFR F [1,2]의 X L-DHFR F [3], 지퍼 링커 – DHFR 배체 계통 및 링커 DHFR 배체 주). 1.1.2.6에서 생성 된 미끼 균주의 글리세롤 주식의 플레이트 2-3 μL), L-DHFR F [3] 제어 변형, YPD + 냇, YPD에 지퍼 링커 – DHFR와 링커 DHFR 배체 계통 + HygB 두 번 YPD + 냇 + HygB 미디어, 각각. 대신 YPD + 냇 매체의 YPD + HygB 매체에 부담을 DHFR F [3] 수집에 관심있는 먹이를 검색하고 1.1.1의 지침에 따라,하지만 행진. 먹이 궤적과 순서 제품에 [3] 융합 DHFR F를 확인하기 위해 1.1.2.4으로하는 진단 PCR을 수행합니다. 짝짓기를 반수체 균주 액체 YPD 배지 1 ㎖를 접종 (미끼는 미끼 x 길이-DHFR F [3] 제어, 먹이를 x)와 diploids이 형성 할 수 있도록 30 ° C에서 적어도 이일 성장한다. 고체 YPD + HygB + 냇 매체에 7.4 문화의 4-5 μl를 줄무늬로 diploids을 선택합니다. 30 ° C에서 이일 성장. SELECt 하나의 고립 된 식민지와 액체 문화 (1 ml)에 하룻밤 성장은 성장 분석을 수행 할 수 있습니다. 사용하기 전에 하루 MTX 및 DMSO (MTX 매체와 동일 성분,하지만 MTX없이) 판을 준비합니다. 자세한 내용은 단계 4.11를 참조하십시오. 제어 (DMSO) 및 선택 판 (MTX)의 서로 다른 문화의 연속 희석을 잡아 내 성장 분석을 수행합니다. OD = 1 precultures을 희석. 멸균 96 웰 플레이트 (625의 희석 배수까지) 5 배 희석을 수행합니다. 스팟 PCA 미디어 (DMSO와 MTX)에 각 희석의 4 μL. 건조를 방지하기 위해 비닐 봉지에 30 ° C에서 품어. 로봇 플랫폼이나 일반 디지털 카메라를 사용하여 1 배양 7 일부터 이미지가 접시.