对专为递送治疗因素的神经保护策略成人干细胞高通量表征

1.基板制备的96孔板创建的96孔板，概述了不同底物和细胞类型的地图要被检查（ 图1）。 得到储备溶液不同的基板〔聚-L-赖氨酸，纤连蛋白，I型胶原，层粘连蛋白，巢蛋白和胶原IV-层粘连蛋白（ECL）]，在96孔多孔板，并准备一个工作台在无菌细胞培养物的引擎盖。 通过在无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）稀释的库存为5微克/毫升的最终浓度（基于用于细胞的生长和增殖的基质浓度依赖性测定预先决定该浓度）制备个别基板。混合使用涡流倒入无菌贮存器之前。 加入100微升底物溶液导入各孔中，根据所述96孔图谱（ 图1）（12或8通道微量便于micropipetting到96孔板）。密封盖子的96孔板用封口膜条和隔夜存放于4℃。 2.细胞电镀和时间推移成像注：鼠标的MSC从成年C57BL / 6小鼠的骨髓中分离，并保持作为贴壁细胞系。利用慢病毒载体的编码BDNF（LV-BDNF;和神经胶质细胞源性神经营养因子（人cDNA GDNF）;干细胞用慢病毒载体改造它们分泌脑源性神经营养因子（人cDNA BDNF）感染CMV-BDNF-IRES -GFP），GDNF（LV-GDNF; CMV-GDNF-IRES-GFP）和绿色荧光蛋白（GFP，LV-GFP; CMV-GFP）。 注：培养基为小鼠间充质干细胞（MSCs）是Iscove氏改良的Dulbecco氏培养基含有10％杂交瘤合格的胎牛血清，10％马血清，2mM的L-谷氨酰胺，和10000 U / ml的青霉素，10mg / ml的链霉素。五种不同类型的小鼠的MSCs（MSCS，GFP-的MSC，BDNF-GFP-的MSC，GDNF-GFP-M的种姓和BDNF / GDNF-GFP-的MSCs）接种在T75细胞培养瓶约30％汇合。 细胞电镀 第二天，除去通过抽吸基片的解决方案，并与大约200微升无菌PBS冲洗井每两次。最终的PBS漂洗后添​​加细胞培养基（200μl/孔）到每个孔中。将96孔板入细胞培养孵化器设置在37℃和5％CO 2的平衡。 而在96孔板被平衡在孵化器，收获细胞（在T75烧瓶的MSC应该大约70％汇合时收获/电镀时间）通过收集生长培养基从T75烧瓶（被称为条件培养基），并存储在无菌条件下的15毫升锥形管中（此条件培养基将在下面步骤2.1.4使用）。 加入8毫升无菌PBS中至烧瓶中并轻轻摇动，然后移液器关闭PBS中，并加入1 ml 0.05％胰蛋白酶和0.01％EDTA溶液从T75烧瓶的培养表面分离细胞。通过使用倒置显微镜配备相衬光学观看烧瓶监测细胞脱离。 当细胞已经分离时，立即加入8毫升条件培养基（收集步骤2.1.2）的烧瓶中。收集的细胞悬浮液，并在450×g离心转移到15毫升锥形离心管中，离心4分钟以沉淀细胞。 除去上清液和重悬细胞沉淀在200微升新鲜和温热（37℃）的细胞培养介质。 通过使用血细胞计数器进行锥虫蓝活细胞计数测定细胞中的细胞悬浮液的数量。板中的细胞以大约300个细胞/孔的密度向96孔板的适当孔中。 重复这些步骤细胞的每个群体。 时间推移成像 一旦所有的干细胞都被镀，地点的96孔板进培养箱2小时，以使干细胞附着于基底上。 启动HCS系统和等待2小时，以便系统平衡。设置环境控制器至37℃，并连接含有5％的CO 2在空气中的HCS系统环境室供给一个恒定的空气源的混合气体钢瓶。 从培养箱以下的2小时的平衡期取出96孔板，并直接放置到HCS系统的细胞生长室。允许30分钟以达到平衡，以占该板的任何热相关的膨胀，然后启动图像采集和分析软件来配置该板设置。 选择20X客观的成像。选择[ 即，GFP-的MSC上纤连蛋白等。（6基板×5的MSC亚型为总共30条件式两次= 60井总数）]用于设置延时成像每种条件两口井。选择两个站点的成像在每个孔中。 选择正确的光的波长的成像。 注：两个不同的波长（相衬和GFP荧光）被选定为延时成像。 着眼于用激光自动对焦的井底，并采取测试图像的多个站点和不同井找到一个优化的焦平面。 一旦焦点已经成立，开始捕获图像，每5分钟48小时为所有60口井（120点）。 通过从HCS体系中除去96孔板喂细胞每隔24小时。从每个除去75微升培养基井，并添加100微升新鲜培养基到每个孔中（平衡在37℃和5％的CO此新鲜培养基2）。 在时间推移实验结束时，取出96孔板从HCS系统。在无菌条件下，收集从各条件培养基样品井并且这些样品转移到另一96孔板中。 注意：这些样品可用于进一步analys是通过执行ELISA的神经营养因子。 制备的96孔板用培养的MSC的额外分析如Ki67的细胞增殖测定或碘化丙啶活/死染色法（见下文）。 如在下面第5节中描述为细胞迁移/细胞跟踪执行延时成像分析。 3，Ki67的细胞增殖和碘化丙啶活/死测定 Ki67的细胞增殖试验（免疫细胞） 冲洗的细胞培养物用0.1M磷酸盐（PO 4）缓冲液一分钟两次。固定培养，用4％多聚甲醛（PFA）进行20分钟，在室温下。取出PFA和冲洗井PBS七分钟三次。 在最后冲洗后，加入100微升阻断溶液（磷酸盐缓冲盐水，5％正常驴血清，0.4％牛血清白蛋白，和0.2％的Triton X-100），以每孔一个次在室温下孵育1小时。 200：通过以1:1的加工率稀释于阻断溶液制备第一抗体，兔抗Ki67。 除去阻断溶液并应用100微升的初级抗体溶液，每孔。覆盖96孔板，孵育的样品在4℃下过夜。 次日，除去抗体溶液和冲洗用PBS为7分钟，3次。 制备第二抗体，驴抗兔Cy3的在封闭液以1:1的加工率：500。添加的DAPI核染色的二级抗体溶液的稀释度为1：100。在除去最后的PBS冲洗后，将100μl的第二抗体/ DAPI溶液的各孔。在黑暗中在室温下孵育90分钟。 除去二级抗体/ DAPI溶液和7分钟，3次，用PBS冲洗井每个。覆盖96孔板，并储存在4℃直至成像。 Propidium碘化物活/死测定如下所述测量细胞死亡通过碘化丙啶（PI）排除测定。 准备以1.5μM的在培养基中的浓度的碘化丙啶染色溶液。 加入100微升70％乙醇的MSC的一个阱2分钟以杀死这些细胞的意图。这口井用作阳性对照为PI染色。大多数干细胞将是PI染色表明细胞死亡。除去乙醇溶液。 加入100微升的碘化丙啶染色溶液至每孔，并在5％CO 2培养箱孵育20分钟，在37℃。 冲洗细胞，用0.1M磷酸缓冲液，1分钟，2次。固定的细胞用4％PFA中的0.1M PO 4缓冲液中20分钟，在室温下。除去PFA和冲洗用PBS三次7分钟。 孵育用DAPI溶液（1:50）稀释于阻断溶液中1小时，在室温下进行。冲洗所有井PBS中7分钟，3次。 取出的DAPI溶液和7分钟，3次，用PBS冲洗井每个。覆盖96孔板，并储存在4℃直至成像。 4.自动成像和多波长分析评分加载一个96孔板（先前处理对于Ki67的免疫标记或碘化丙啶染色的）插入HCS系统，并允许所述板中平衡20分钟，打开的HCS系统的图像采集和分析软件。 选择用于使用照相机像素合并为1和2的增益设置查找的Z平面，其中所述细胞位于通过利用​​自动曝光功能并计算偏移为每个感兴趣的波长的10X物镜采集设置。对于这种分析，捕捉图像为DAPI（W1），Cy3标记（W2），和FITC（W3）。选择的最大强度电平，在该阴性对照孔显示为图像采集没有信号。确认此设置适合的POS可持续的竞争井。 收购板块。捕捉图像并将其存储在图像采集和分析软件的数据库中。 一旦图像已被收购，收购上述从图像中打开的图像采集和分析软件的离线和审查板的数据。 选择多波长得分分析。配置的最小和最大强度为每个波长。 注：DAPI检测应当标注各地的每个可见细胞核染色。 Cy3的应检测的阳性细胞与Ki67免疫反应（IR）和下的阴性对照不应该检测红外线。对于Cy3的Ki67的红外光谱，近似最小宽度是7μm，近似最大宽度为30μm，上述局部背景的强度为150灰度级，最小染色面积为50μm2。 所有职位运行分析。导出数据，查看电子表格。 5.细胞跟踪打开图像习得n和分析程序，然后点击“评论板块数据[DB] …”，选择感兴趣的板块。 查看数据为“时间与井”。 选择所需的选择“网站”由左击节的地点之一。选择“传送…”下的“波长”。右键单击目标以及96孔板模板，并点击“载入图像”。 通过点击“应用程序”，然后在“跟踪对象”追踪细胞。 使用“动态数据交换（DDE）”选择格式导出的数据， 例如，Microsoft Excel中。 选择跟踪数据出口， 例如，经过的时间，对象，数量，距离，时间间隔，速度，绝对角度，距离的起源，增量X和增量Y。 标签与靶细胞“Ctrl键+鼠标左键单击”利息每一个细胞。 追踪细胞。如果有必要，停止/更改不当追踪细胞与“Esc”键，然后调整设置。 经过细胞跟踪完成后，保存的数据与“日志数据”。