Нервно-мышечном соединении: Synapse размер измерение, фрагментации и изменения в синаптической белка плотности с использованием конфокальной флуоресцентной микроскопии

Нервно-мышечном соединении (НМС) является критическим реле синапсов, что опосредует связь между нервной системы и скелетных мышцах. Это требуется для всех произвольных движений. Флуоресцентная микроскопия уже давно используется для изучения влияния трансгенов на мышь NMJ ^1-3 или сравнить эффекты от возраста, диеты, физические упражнения и болезни на грызунов NMJs ^4-11. Такие исследования научили нас много о физиологии и патофизиологии НМС, но различные параметры сообщалось (например, AChR площадь, Концевая пластина площадь, длина периметра, индексы фрагментации) часто затрудняют сравнение результатов этих исследований. Существует растущая ожидание доклинические исследователи, чтобы иметь возможность продемонстрировать воспроизводимость, в частности, в исследованиях с грызунами моделей болезни ^12. Протоколы, описанные здесь, были уточнены в ходе ряда исследований, которая расследовала развития, физиологических и патофизиологических чАнгелов в НМС. Такие исследования требуют измерения области синаптических специализаций на двигателе мыши концевой пластинки и относительной плотности упаковки синаптических белков в постсинаптической специализаций ^13-15.

Полезность этих методов свидетельствуют недавние исследования в мышиной модели анти-мускуса миастения. Ежедневные инъекции IgG из анти-мускусный положительного миастения пациентов в взрослых мышей заставило их стать слабыми в течение 2 недель ^16. Конфокальные максимальной проекции изображения мышечных разделов, которые были дважды мечеными для синаптофизина (в нервных терминалов) и постсинаптических АХР показали прогрессирующее снижение в области АХР окрашивания в качестве основного изменений. Важно темпы снижения было достаточно, чтобы объяснить, сопоставимые снижение амплитуды синаптических потенциалов, отказ от синаптической передачи и мышечной слабости ^17,18. Качественно аналогичные результаты были получены и другими исследовательскими группами^10,19. Те же НМС методы измерения, поскольку были использованы для оценки влияния трех препаратов для лечения анти-мускуса миастения в этой модели мыши ^20,21.

Сидячий старение может привести к потере нервно-мышечных соединений. Протоколы, описанные здесь, выявили снижение, связанное с возрастом в области нервных окончаний синаптофизина на двигателе концевых пластинок, как у мышей прогресс в пожилом возрасте. Те же методы показали, что добровольным мероприятием можно в значительной степени предотвратить уменьшение площади ²² терминала пресинаптических нервных, в соответствии с предыдущей работой со стороны других групп ^4. Потеря нервно-мышечных соединений также происходит в модели SOD1G93A мыши бокового амиотрофического склероза ^9,23.

Исследования, упомянутые выше, показывают, что многие факторы здоровья могут привести к сокращению в области либо до или после синаптических специализаций НМС. Это может привести к нарушению синаптической удовольствияие или может предвещать полную потерю нервно-мышечного соединения. Три протокола описан, что позволит количественно оценивать площади и плотности синаптических специализаций. Цель первого протокола является создание практического и воспроизводимое измерение области до и после синаптических специализации и их выравнивание при НМС млекопитающих, с помощью флуоресцентной микроскопии. Двумерные максимальной проекцией конфокальной изображения и анализа изображений с NIH ImageJ используется для обнаружения изменений в области синаптофизин окрашивания (синаптические пузырьки), постсинаптических АХР и синаптической области перекрытия. Конфокальные параметры визуализации (усиление и смещение уровня) оптимизированы для каждого НМС так, чтобы максимизировать визуальную информацию, используемую для разглядеть площадь синаптической специализации. Нервно ошибка может также возникнуть в результате изменений в плотности постсинаптических AChR и / или других синаптических белков. Второй протокол может быть применен для обнаружения изменений в относительной плотности постсинаптических белков, такихкак мускус, rapsyn, Dystroglycan, фосфорилированного Src киназы и фосфорилирования AChR ^18,21.

В миастения, снижение плотности АЧР в постсинаптической мембране Непосредственной причиной синаптической недостаточности и мышечной слабости. Третий протокол описывает метод флуоресцентного резонанса Передача энергии (FRET), чтобы оценить изменения в непосредственной близости от соседних АХР в постсинаптических мембранах ^14,15. Этот метод определяет передачу энергии между соседними АХР, меченных флуоресцентной-α-бунгаротоксина (BGT). FRET происходит только тогда, когда флуоресцентные донорные и акцепторные зонды менее 10 нм друг от друга. Это может выявить (субмикроскопические) изменения в герметичности АХР упаковки, которые могут непосредственно связанные с амплитудой синаптических потенциалов.

Эти три протокола, совершенствуется на протяжении последнего десятилетия, обеспечивают дополнительные меры NMJ целостности в последовательной и воспроизводимой образом. Использование стандартных протоколов Ай параметры должны облегчить сравнение эффектов генов и окружающей среды вмешательств на млекопитающих НМС.