Chirurgische Verfahren zum viral vermittelte Gentransfer in die Maus-Innenohr über die runde Fenstermembran

Die Gentherapie ist seit langem als mögliche Behandlung für genetische Schwerhörigkeit vorgeschlagen worden, aber der Erfolg in diesem Bereich schwer zu ¹ blieb. Bisher wurden viral vermittelten Methoden aufgrund der theoretischen Möglichkeit, bestimmte Zelltypen innerhalb des relativ unzugänglich Cochlea gezielt überwogen. Beide Adenovirus (AV) und Adeno-assoziierten Virus (AAV) wurden für Cochlea-Genübertragung verwendet. AAVs sind vorteilhaft in der Cochlea für eine Reihe von Gründen. Sie sind replikationsdefizienten Viren und effizient transgenen Moleküle zu übertragen, um verschiedene Zelltypen, einschließlich Neuronen, ein wichtiges Ziel für eine Reihe von Ursachen für Hörverlust. AAV Eintritt in die Zelle durch spezifische Rezeptoren vermittelt ^2; Somit muss die Wahl eines bestimmten Serotyps kompatibel sein mit den Zelltypen zu transduzieren. AAVs effektiv transfizieren Haarzellen ³ und enthalten in das Wirtsgenom, was zu einer stabilen, langfristige Expression des transgenic Protein und phänotypische Veränderungen in der Zelle ^4. Obwohl nicht unbedingt für kurzfristige Anwendungen wie Haarzellenregeneration vorteilhaft, eine langfristige Expression für stabile Rettung von genetischen Defekten sehr wichtig. Da AAVs sind nicht mit einem menschlichen Krankheit oder Infektion assoziiert und zeigen keine Ototoxizität ^5,6,7, sind sie ein idealer Kandidat für den Einsatz in der Gentherapie für vererbte Formen von Hörverlust ^8.

Transfer von exogenem genetischen Material in den Säugetierinnenohr mittels viraler Vektoren ist im letzten Jahrzehnt untersucht und ist als vielversprechende Methode zur Behandlung von sowohl genetische und erworbene Formen von Hörverlust ⁹ entstehen. Die Cochlea ist potentiell ein ideales Ziel für die Gentherapie aus mehreren Gründen: 1) seines kleinen Volumens eine begrenzte Menge des Virus notwendig erfordert; 2) ihre relative Isolierung von anderen Organsystemen Grenzen Nebenwirkungen; und 3) ihre fluidgefüllten Kammern erleichtern viralenLieferung in ganz Labyrinth ^{10, 11,12,13,14, 15.}

Mausmodelle für angeborene Taubheit ermöglichen den Einsatz von vielen Methoden der Untersuchung der Entwicklung des Innenohrs in einem systematischen, replizierbar Weise überwachen. Während die geringe Größe der Maus cochleae nicht präsentieren einige chirurgische Schwierigkeit dient die Maus als ein äußerst wichtiges Modell in der Studie der genetischen Hörverlust, mit mehreren experimentellen Vorteile gegenüber anderen Arten ^16. Mausmodelle ermöglichen Einschätzung einer Reihe von Eigenschaften durch genetische Kopplungsanalyse, Sammlung von detaillierten morphologischen Beobachtungen und Simulation pathogenen Szenarien; als solche sind sie gute Kandidaten für die viral vermittelten Gentherapie. Umfangreiche genetische Studien an Mäusen in Kombination mit technologischen Fortschritte haben es möglich gemacht, gentechnisch veränderten Mäusen reproduzierbar über Labors ^{17,18, 19, 20,21} erzeugt. Furthermore, gibt es zahlreiche Modelle für sowohl erworbene und vererbte Schwerhörigkeit Phänotypen bei Mäusen, so dass strenge Tests in diesem Tiermodell ^{22, 23,24.} So korrigieren Anhörung mit viral vermittelten Gentherapie in einem Mausmodell ist eine geeignete erste Schritt bei der Suche nach einem Heilmittel für Erkrankungen des Menschen.

Wir haben bereits gezeigt, dass transgene Mäuse, denen vesikulären Glutamattransporter 3 (VGLUT3) werden taub geboren wegen des Mangels an Glutamatfreisetzung an der IHC Bandsynapse ^25. Da diese Mutation nicht auf eine Primär Degeneration der Haarsinneszellen führen, sind diese mutierten Mäusen möglicherweise ein ausgezeichnetes Modell, in der Cochlea Gentherapie für angeborene Hörverlust testen.

Bisher wurde eine Reihe von viralen Abgabetechniken für Cochlea Gentherapie beschrieben wurden, einschließlich runden Fenstermembran Diffusion runde Fenstermembran Injektion und Abgabe über einen Cochleostomie. Es gibt starkeial Vor- und Nachteile von jedem dieser Ansätze ^9.

Hier berichten wir über eine chirurgische Methode für viral vermittelte Genübertragung auf die VGLUT3 KO Maus Innenohr durch die Rundfenstermembran (RWM). Die Post-Ohr RWM-Einspritzverfahren ist minimal-invasiv mit ausgezeichneten Anhörung Erhaltung und ist relativ schnell. Wie wir bereits veröffentlicht, in dem Bemühen, wiederhergestellt in diesem Mausmodell Gehör ein AAV1 Vektor, der das Gen VGLUT3 (AAV1-VGLUT3) in die Cochlea dieser taub Mäusen am postnatalen Tag 12 eingeführt (P! @), Was die Wiederherstellung des Gehör ^26. Anhörung im VGLUT3 KO-Mäusen wurde von akustisch evozierte Hirnstamm (ABR) überprüft, während transgene Protein-Expression wurde mittels Immunfluoreszenz (IF) überprüft. Diese Methodik somit zeigt, dass viral-vermittelte Gentherapie kann einen genetischen Defekt, die ansonsten Ergebnisse würden in Taubheit zu korrigieren.