כימות סימולטני של מעגלי קולטן כריתת T-Cell (TRECs) ומעגלי K-מחיקת רקומבינציה כריתה (KRECs) על ידי בזמן אמת PCR
Summary
Here, we describe a method for simultaneous quantification of T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs). The TREC/KREC assay can be used as marker of thymic and bone marrow output.
Abstract
T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination process that creates T- and B-cell receptors. Because TRECs and KRECs are unable to replicate, they are diluted after each cell division, and therefore persist in the cell. Their quantity in peripheral blood can be considered as an estimation of thymic and bone marrow output. By combining well established and commonly used TREC assay with a modified version of KREC assay, we have developed a duplex quantitative real-time PCR that allows quantification of both newly-produced T and B lymphocytes in a single assay. The number of TRECs and KRECs are obtained using a standard curve prepared by serially diluting TREC and KREC signal joints cloned in a bacterial plasmid, together with a fragment of T-cell receptor alpha constant gene that serves as reference gene. Results are reported as number of TRECs and KRECs/106 cells or per ml of blood. The quantification of these DNA fragments have been proven useful for monitoring immune reconstitution following bone marrow transplantation in both children and adults, for improved characterization of immune deficiencies, or for better understanding of certain immunomodulating drug activity.
Introduction
חוגי כריתת קולט T-cell (TRECs) וחוגי כריתת רקומבינציה מחיקה-K (KRECs) הם מרכיבי DNA circularized קטנים שהם נכרת בשיעור של T- ותאי- B, בהתאמה, במהלך תהליך רקומבינציה הדנ"א הגנומי, שהובילו ל היווצרות של רפרטואר מגוון מאוד של T- וקולטנים B-cell. אין להם פונקציה, אלא משום שהם יציבים ולא ניתן לשכפל, הם מדוללים לאחר כל חלוקת תא, ובכך מתמידים רק באחת משני התאים הבת. לכן, רמותיהם בדם ההיקפי ניתן להניח כאומדן של תפוקת מח הרתי ועצם.
בעוד assay TREC כבר בשימוש במידה רבה ב -15 השנים האחרונות על מנת להעריך את היקף תפוקת הרתי, 1 assay KREC, שבמקור פותח כדי למדוד התפשטות B-cell ותרומתה להומאוסטזיס B-cell בבריאות ובחוליים, 2 הוצע רק לאחרונה כסמן של עצם מ 'חץ תפוקה. 3,4 כאן, אנו מתארים את השיטה שפיתחנו עבור הכימות בו זמנית של שני TRECs וKRECs. 4
בשיטה משולבת זו, שונות הקשורים לכימות DNA על ידי בזמן אמת PCR מתבטל על ידי השימוש בעקומת סטנדרט ייחודי שהושגה על ידי דילול פלסמיד משולש להוסיף מכיל שברי TRECs, KRECs וקבוע אלפא קולטן T-cell (TCRAC) גן ביחס של 1: 1: 1. זה מאפשר הערכה מדויקת יותר של עותק מספר TREC וKREC. יתר על כן, הכימות בו זמנית של שתי מטרות באותה התגובה מאפשר הפחתת עלויות מגיב.
Assay TREC / KREC המוצע יכול להיות שימושי כדי למדוד את היקף T- והניאו-ייצור B-cell בילדים או מבוגרים עם חמור משולב כשל חיסוני (SCID), 4 כשל חיסוני נפוץ משתנה, 5 מחלות אוטואימוניות, 6-8 והידבקות ב- HIV . 9 יתר על כן, ניתן להשתמש בו ללפקח על ההתאוששות החיסונית לאחר השתלת תאי גזע hematopoietic, 10 אנזימים חלופיים, 11 ו -9 אנטי או אימונומודולטוריים טיפולים. 6-8 לבסוף, משום שחולי SCID מוכרים באמצעות assay TREC למרות הפגמים הגנטיים הבסיסיים, וagammaglobulinemia ניתן לזהות מטופלים באמצעות כימות KREC , Assay TREC / KREC יכול לשמש גם כדי לזהות כשלים חיסוניים, בתוכניות הקרנת יילוד. 12 במקרה זה, הבדיקה חייבת להתבצע על DNA שחולץ מכתמים קטנים של דם מחק ויבשה על נייר סינון, חייב להיות רגיש וספציפי למאוד המחלות היעד, כמו גם אפקטיבי עלות לשחזור ומאוד.
כניסתה של כימות KREC במבחן צריכה לשפר את הביצועים של הקרנת יילוד לחסרים חיסוניים, אשר באופן שיגרתי שבוצעו בחלקים מסוימים של ארה"ב (WI, MA, CA) מאז 2008, כאשר ויסקונסין היה ראשון שintroducדואר ניתוח TRECs בתכנית ההקרנה לאחר לידתה. 13
Protocol
Representative Results
Discussion
TREC and KREC quantification can be considered a good estimate of recent thymic and bone marrow output provided that some caveats are taken into account. Even though an absolute quantification method employing standard curve requires more reagents and more space on the real-time PCR reaction plate, it ensures highly accurate quantitative results because unknown sample quantities are interpolated from standard curves built upon known amounts of starting material. Moreover this method is better fitted to detect low amount …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Histopaque-1077 | Sigma Aldrich SRL | 10771-500 ML | density gradient separation method |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit (250) | QIAGEN | 51106 | DNA extraction |
| Unmodified DNA Oligonucleotides HPSF 0.01 mmol | Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l | Resuspend the lyophilized product to 100 picmol/µl | |
| AmpliTaq DNA Polymerase: including 10x Buffer II and 25mM MgCl2 | Applied Biosystems/Life-Technologies | N8080156 | |
| GeneAmp dNTP Blend (100 mM) | Applied Biosystems/Life-Technologies | N8080261 | |
| TOPO TA Cloning Kit for Subcloning | Invitrogen/Life-Technologies | K4500-01 | |
| XL1-Blue Subcloning Grade Competent Cells | Stratagene | 200130 | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1223 | |
| SpeI 500U | New England Biolabs | R0133S | |
| HindIII-HF 10,000 U | New England Biolabs | R3104S | |
| PureYield Plasmid Midiprep System | Promega | A2492 | |
| XhoI 5,000 U | New England Biolabs | R0146S | |
| TRIS Utrapure | Sigma Aldrich SRL | T1503 | |
| EDTA | Sigma Aldrich SRL | E5134 | |
| TE buffer (1 mM TRIS and 0.1 mM EDTA) | |||
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems/Life-Technologies | 4364338 | |
| Dual labeled probes HPLC 0.01 mmol | Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l | Resuspend the lyophilized product to 100 picmol/µl | |
| NanoDrop 2000c spectrophotometer | ThermoFisher | ||
| Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler | Applied Biosystems/Life-Technologies | 4359659 | |
| Fast 7500 Real-Time PCR system | Applied Biosystems/Life-Technologies | ||
| SDS Sequence Detection Software 1.4 | Applied Biosystems/Life-Technologies |
Riferimenti
- Douek, D. C., et al. Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection. Nature. 396 (6712), 690-695 (1998).
- Zelm, M. C., Szczepanski, T., van der Burg, M., van Dongen, J. J. M. Replication history of B lymphocytes reveals homeostatic proliferation and extensive antigen-induced B cell expansion. J. Exp. Med. 204 (3), 645-655 (2007).
- Fronkova, E., et al. B-cell reconstitution after allogeneic SCT impairs minimal residual disease monitoring in children with ALL. Bone Marrow Transplant. 42 (3), 187-196 (2008).
- Sottini, A., et al. Simultaneous quantification of recent thymic T-cell and bone marrow B-cell emigrants in patients with primary immunodeficiency undergone to stem cell transplantation. Clin. Immunol. 136 (2), 217-227 (2010).
- Serana, F., et al. Thymic and bone marrow output in patients with common variable immunodeficiency. J. Clin. Immunol. 31 (4), 540-549 (2011).
- Zanotti, C., et al. Opposite effects of interferon-β on new B and T cell release from production sites in sclerosis. J. Neuroimmunol. 240-241, 147-150 (2011).
- Zanotti, C., et al. Peripheral accumulation of newly produced T and B lymphocytes in natalizumab-treated multiple sclerosis patients. Clin. Immunol. 145 (1), 19-26 (2012).
- Sottini, A., et al. Pre-existing T- and B-cell defects in one progressive multifocal leukoencephalopathy patient. PLoS One. 7, e34493 (2012).
- Quiros-Roldan, E., et al. Effects of combined antiretroviral therapy on B- and T-cell release from production sites in long-term treated HIV-1+ patients. J. Transl. Med. 10, 94 (2012).
- Mensen, A., et al. Utilization of TREC and KREC quantification for the monitoring of early T- and B-cell neogenesis in adult patients after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. J. Transl. Med. 11, 188 (2013).
- Serana, F., et al. The different extent of B and T cell immune reconstitution after hematopoietic stem cell transplantation and enzyme replacement therapies in SCID patients with adenosine deaminase deficiency. J. Immunol. 185 (12), 7713-7722 (2010).
- Borte, S., et al. Neonatal screening for severe primary immunodeficiency diseases using high-throughput triplex real-time PCR. Blood. 119 (11), 2552-2555 (2012).
- Baker, M. W., et al. Implementing routine testing for severe combined immunodeficiency within Wisconsin’s newborn screening program. Public Health Rep. 125 (2), 88-95 (2010).
- Lorenzi, A. R., et al. Determination of thymic function directly from peripheral blood: a validated modification to an established method. J. Immunol. Meth. 339 (2), 185-194 (2008).
- De Boer, R. J., Perelson, A. S. Quantifying T lymphocyte turnover. J. Theor. Biol. 327, 45-87 (2013).
